Оценка эффективности интерферона альфа-2b в комбинации с антиоксидантами в отношении вируса гриппа птиц A (H7N9) in vitro

Показано противовирусное действие интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного в отношении вируса гриппа птиц A (H7N9). При комбинации интерферона альфа-2b с альфа-токоферола-ацетатом и аскорбиновой кислотой его противовирусная активность увеличивае




Effectiveness of interferon alfa-2b in combination with antioxidants against avian influenza A (H7N9) in vitro

The results demonstrate the presence of the antiviral effect of interferon alfa-2b recombinant human in relation to avian influenza A (H7N9). The combination of interferon alfa-2b with alpha-tocopherol acetate and ascorbic acid, its antiviral activity is 8 times increased.

Известно, что вирусы способны к фенотипической и генотипической изменчивости и постоянно формируют опасные для человеческой популяции варианты. Наибольшую проблему с точки зрения эпидемиологии представляет собой изменчивость вирусов гриппа [4]. Одним из механизмов формирования новых вариантов вируса гриппа является формирование реассоциатов в результате смешанного заражения. Наиболее частым источником образования новых вариантов вируса гриппа А являются водоплавающие и другие птицы [1, 4].

В настоящий момент Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) зафиксированы несколько вариантов вирусов гриппа птиц, способных инфицировать человека: штаммы вируса гриппа птиц А (H5N1) и A (H7N9) [1]. Впервые о заражении гриппом птиц A (H7N9) человека было сообщено 31 марта 2013 г. органами здравоохранения Китая, на сегодняшний день в ВОЗ поступили сообщения о 453 лабораторно подтвержденных случаях инфицирования людей вирусом птичьего гриппа A (H7N9), полученные от Национальной комиссии по здравоохранению и планированию семьи КНР, от Гонконгского Центра по охране здоровья и от Центров контроля заболеваний Тайбэя [1].

Оценка эффективности интерферонаНесмотря на незначительное количество сообщений о заражении данным вирусом человека, вирус гриппа птиц A (H7N9) вызывает у врачей обеспокоенность в связи с тем, что у большинства пациентов заболевание протекало в тяжелой форме и в 175 случаях имело летальный исход [1]. Таким образом, своевременный поиск способов лечения данной инфекции является актуальной задачей.

Химиопрепараты против вируса гриппа представлены соединениями, оказывающими свое воздействие на разные стадии репликации вируса гриппа: препараты ремантадина блокируют белок М2 вируса гриппа. Препараты занамивир и осельтамивир действуют как ингибиторы нейраминидазы. В отношении препаратов группы ремантадина можно отметить их высокую токсичность и низкую эффективность, так как они активны только в отношении гриппа А, но не против гриппа В. Ингибиторы нейраминидазы являются эффективными препаратами, но, имея высокую стоимость, менее доступны для населения.

В организме человека основной системой, ответственной за борьбу с вирусными инфекциями, является система интерферона. В арсенале современной медицины имеются препараты рекомбинантного интерферона альфа-2b, широкий спектр противовирусной активности которых характеризован в многочисленных исследованиях как in vitro, так и in vivo [5].

По данным различных исследователей эффективность терапии интерфероном альфа-2b вирусных инфекций можно значительно повысить при помощи антиоксидантов [2, 3, 7, 8]. Впервые о синергизме интерферона альфа-2b и антиоксидантов в терапии вирусных инфекций сообщалось в работах В. В. Малиновской. По данным [7, 8] комбинация интерферона альфа-2b и антиоксидантов iv vitro и in vivo имеет выраженный синергидный эффект: в присутствии антиоксидантов специфическая противовирусная активность интерферона увеличивается в несколько раз, что позволяет не только повысить эффективность терапии, но и снизить возможность проявления побочных эффектов.

Целью настоящей работы явилось изучение противовирусной активности интерферона альфа-2b как противовирусного препарата в отношении вируса гриппа птиц A (H7N9) и оценка влияния антиоксидантов на течение экспериментальной инфекции in vitro.

Материалы и методы исследования

Культура клеток

Линия клеток почки зеленой мартышки Vero клон Е6, получена из лаборатории культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Культуру клеток выращивали в виде монослоя в 96-луночных планшетах при 37 °С в атмосфере 5% СО2 с использованием среды Игла МЕМ с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 150 мкг/мл и 10% сыворотки крови эмбрионов коров (ростовая среда). В качестве поддерживающей использовали среду Игла с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 150 мкг/мл и 2% инактивированной при 56 °С сыворотки крови эмбрионов коров.

Вирус

Штамм вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) получен из лаборатории Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Для культивирования использовали алантоисную полость 9–10-дневных куриных эмбрионов.

Препараты

  • Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, Р N003726/01, производства ООО «Фармапарк», Россия, активность 4 × 108 МЕ/мл. Обладает выраженной противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностью. В качестве референса активности интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного использовали международный стандарт активности интерферона (International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566).
  • Аскорбиновая кислота (витамин С), ЛС-000420, производства «ДСМ Нутришнл Продактс (ЮК) Лимитед», Великобритания. Является высокоактивным природным антиоксидантом, нейтрализует свободные радикалы, обладает способностью восстанавливать активную форму витамина Е.
  • Аскорбат натрия, ЛС-000423, производства «ДСМ Нутришнл Продактс (ЮК) Лимитед», Великобритания. Является натриевой солью аскорбиновой кислоты, имеет аналогичную биологическую активность с аскорбиновой кислотой, но в отличие от нее обладает меньшим поверхностным раздражающим действием.
  • Альфа-токоферола ацетат (витамин E), dl-альфа-токоферола ацетат, тип CWS/F500, водорастворимая форма, производства Sigma Aldridsch, США. Является высокоактивным природным антиоксидантом и антигипоксантом, нейтрализует свободные радикалы и перекиси жирных кислот, активные формы кислорода, способен предотвращать перекисное окисление мембран клеток.
  • Мексидол (этилметилгидроксипиридина сукцинат), P N002161/01, производства ООО «НПК Фармасофт», Россия. Является высокоактивным синтетическим антиоксидантом, нейтрализует свободные радикалы.

Цитотоксичность

Оценку цитотоксичности препаратов проводили по стандартной методике [6] путем инкубации 1-суточного монослоя клеточной культуры Vero клон Е6 с различными концентрациями препаратов в течение 72 часов в 96-луночных планшетах при 37 °С в атмосфере 5% СО2. После инкубации клетки отмывали раствором Хенкса, для подсчета количества клеток использовали автоматический счетчик клеток Cauntess, производства Invitrogen, США с применением 0,4% раствора трипанового синего. За ЦД50 (50% тканевая цитопатическая доза) испытуемого образца принимали максимальную концентрацию, способствующую выживанию не менее 50% клеток по сравнению с контролем. За МПК (максимально переносимая концентрация) испытуемого образца принимали максимальную концентрацию испытуемого образца, не вызывающую видимых изменений в жизнеспособности клеток.

Антивирусная активность

Антивирусную активность оценивали по уровню подавления цитопатического действия вируса различными разведениями препаратов и комбинаций на культуре клеток Vero клон Е6. Для работы использовали 1-суточный монослой культуры, выращенный в 96-луночных планшетах. Множественность инфицирования вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) составила 0,1 ТЦД50 на клетку, продолжительность инкубации 48 часов при 37 °С в атмосфере 5% СО2. За ИК50 (50% ингибирующая концентрация) принимали концентрацию испытуемого образца, при которой клеточная культура оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса в 50% лунок.

Результаты и обсуждение

Изучение цитотоксического действия препаратов

Определенные максимальные переносимые концентрации препаратов, не оказывающие цитотоксического действия на культуру клеток Vero клон Е6, приведены в табл. 1.

Для работы на культуре клеток при определении антивирусной активности использовали концентрации препаратов меньше или равные МПК, указанные в табл. 1.

Цитотоксические свойства и антивирусная активность препаратов

Изучение антивирусной активности препаратов

Определенные для препаратов ИК50 в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) представлены в табл. 1. Для оценки возможной перспективы использования препарата в качестве химиотерапевтического средства в отношении вирусной инфекции использовали понятие ХТИ (химиотерапевтический индекс) — отношение максимально переносимой концентрации препарата к ИК50. Для эффективных противовирусных препаратов величина ХТИ должна быть более 3. Полученные данные в отношении антивирусной активности исследуемых препаратов показывают, что интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный может быть использован в качестве средства противовирусной терапии инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9). Также показано, что антиоксидант Мексидол обладает слабовыраженной противовирусной активностью со значением ХТИ 4,0.

Изучение антивирусной активности комбинаций препаратов

Для изучения влияния антиоксидантов на антивирусную активность интерферона альфа-2b готовили растворы исследуемых препаратов с различной концентрацией как интерферона альфа-2b, так и антиоксидантов. Для оценки эффективности комбинации использовали понятие фракционного ингибирующего коэффициента (ФИК), значение которого вычисляли по формуле (ИД50 — 50% ингибирующая доза):

Оценка эффективности интерферона альфа-2b в комбинации с антиоксидантами в отношении вируса гриппа птиц A (H7N9) in vitro

При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении ФИК, равном 1,0–1,5, имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК более 2 имеет место антагонизм соединений [9]. Результаты оценки влияния антиоксидантов на антивирусную активность интерферона альфа-2b приведены в табл. 2.

Влияние антиоксидантов на противовирусную активность интерферона

Из представленных данных видно, что антиоксиданты оказывают стимулирующее действие на противовирусную активность интерферона альфа-2b: в присутствии разных концентраций антиоксидантов ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 2 и более раза. Так, например, в присутствии аскорбиновой кислоты в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании концентрации 2,5 мкг/мл — в 2 раза. В присутствии аскорбата натрия в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании концентрации 2,5 мкг/мл — в 4 раза. При использовании альфа-токоферола ацетата в концентрации 25 мкг/мл и 2,5 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз. При совместном использовании с Мексидолом в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании в концентрации 2,5 мкг/мл — в 4 раза.

При анализе эффекта комбинированного применения антиоксидантов и интерферона альфа-2b путем расчета ФИК получены данные, демонстрирующие явно выраженный синергидный эффект для всех комбинаций, причем максимальный синергидный эффект наблюдали при комбинировании с альфа-токоферола ацетатом. Чуть менее выраженный синергидный эффект наблюдали при совместном применении интерферона альфа-2b и аскорбиновой кислоты, наименее выраженный синергизм наблюдали для комбинации интерферона альфа-2b и Мексидола.

Выводы

Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный является эффективным препаратом в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9), значение химиотерапевтического индекса препарата равно 16. Применение интерферона альфа-2b в комбинации с антиоксидантами повышает его эффективность в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) в 8 раз, до величины химиотерапевтического индекса 128.

Литература

  1. Бюллетень ВОЗ «WHO RISK ASSESSMENT. Human infections with avian influenza A (H7N9) virus» от 02.10.2014 г.
  2. Васильев А. Н. Оценка влияния антиоксидантов на специфическую противовирусную активность интерферона алфьа-2 b человеческого рекомбинантного в отношении вируса простого герпеса в культуре клеток // Антибиотики и химиотерапия. 2010. № 7. С. 20–25.
  3. Васильев А. Н., Дерябин П. Г., Галегов Г. А. Протвовирусная активность антиоксидантов и их комбинаций с интерфероном альфа-2b человеческим рекомбинантным в отношении вируса гриппа птиц А/H5N1 // Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 2. С. 32–36.
  4. Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия / Под ред. О. И. Киселева, И. Г. Маринича, А. А. Сомининой. Монография. СПб, 2003, 244 с.
  5. Ершов Ф. И., Киселев О. И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М., 2005. 368 с.
  6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р. У. Хабриева. М., 2005.
  7. Темичева Е. В., Малиновская В. В., Манахова Л. С. и др. // Вопросы вирусологии. 1986. № 1. C. 12–18.
  8. Темичева Е. В. Интерфероновый статус при рецидивирующем герпесе гениталий и коррекция его нарушений. Автореф. дисс. … канд. мед. наук. М., 1989.
  9. De Clercq E., Sakuma T., Baba M., Pauwels R., Balzarini J., Rosenberg I., Holý A. Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines // Antiviral research. 1987. Vol. 8. № 5–6. Р. 261–272.

П. Г. Дерябин1, доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН
Г. А. Галегов, доктор медицинских наук, профессор

ФГБУ ФНИЦЭИМ им. Н. Ф. Гамалеи МЗ РФ, Москва

1 Контактная информация: pg_deryabin@mail.ru



Еженедельный дайджест "Лечащего врача": главные новости медицины в одной рассылке

Подписывайтесь на нашу email рассылку и оставайтесь в курсе самых важных медицинских событий


поле обязательно для заполнения
поле обязательно для заполнения
поле обязательно для заполнения
поле обязательно для заполнения
Нажимая на кнопку Подписаться, вы даете согласие на обработку персональных данных

Актуальные проблемы

Специализации




Календарь событий:




Вход на сайт