Особенности полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы у детей с идиопатическим синдромом слабости синусового узла

У детей с идиопатическим синдрома слабости синусового узла (СССУ) преобладает гомозиготный генотип 4а/4a гена eNOS по сравнению c контрольной группой, что указывает на высокую вероятность развития аритмий и может быть использовано для выявления предраспол




Features of polymorphism of endothelial NO-synthase in children with idiopathic sick sinus syndrome

In children with idiopathic sick sinus syndrome (SSS) there is a prevalence of a homozygous genotype 4a / 4a eNOS gene compared to control group, which indicates to a high likelihood of arrhythmias development and can be used to detect hereditary predisposition to SSS.

Оксид азота (NO) — основной эндотелиальный фактор релаксации — экспрессируется практически во всех типах клеток миокарда. Вызывает расслабление гладкой мускулатуры сосудов, участвует в поддержании тонуса сосудистой стенки, обладает пролиферативными и противовоспалительными свойствами [1]. Различают несколько изоформ NO-синтаз с различной локализацией, регулированием и каталитическими свойствами, впервые описанными в 1989 г. Основное различие между изоформами состоит в количестве синтезируемого NO, продолжительности процесса синтеза, индуцируемости и тканевой специфичности [2].

1-й тип — NO-синтаза нервной ткани, ее ген картирован в хромосоме 12q24.2-12q24.3, имеет 29 экзонов, 28 интронов [3]. 3-й тип — эндотелиальная NO-синтаза (Type III, NOS-3, eNOS), участвует в синтезе NO эндотелием и регуляции сосудистого тонуса. Ее ген локализован в хромосоме 7q35-36, имеет 26 экзонов, 25 интронов и кодирует белок с молекулярной массой 135 кДа, состоящий из 1203 аминокислот. Эти два типа NO-синтаз считаются конституциональными, оказывают влияние на сократительную функцию сердца [2, 4]. 2-й тип — индуцибельная NO-синтаза, вырабатывается в сердце при патологических процессах, ген ее картирован в хромосоме 17 cen-q11.2, имеет 26 экзонов, 25 интронов [5].

eNOS участвует в синтезе NO эндотелием и, следовательно, в регуляции сосудистого тонуса, кровотока и артериального давления. Отвечает за большую часть NO, расширяет все типы кровеносных сосудов, стимулируя растворимые гуанилатциклазы, и увеличивает циклический гуанозинмонофосфат в гладкомышечных клетках [6], генерирует вазопротективные молекулы NO, является мощным ингибитором агрегации и адгезии тромбоцитов [7]. Исследования, проведенные H. Wang и соавт. в 2008 г., показали, что eNOS играет важную роль в предупреждении желудочковых аритмий [8].

Существует ряд полиморфизмов гена, кодирующего eNOS, часть из которых связаны с изменением в плазме крови количества NO [3]: замещение гуанина тимидином в 894 позиции в экзоне 7 (894G>T полиморфизм), связанный с уменьшением базального производства NO [9]; полиморфизм в промоторе 786T>C приводит к значительному сокращению количества eNOS [10]. Полиморфизм в 4-м интроне (27 пн), представленный двумя аллелями: b, в котором имеются 5 повторов длиной 27 пн, и а, в котором только 4 таких повтора [3]. Исследования С. Fatini и соавт. в 2004 г., показали связь генотипа 4a/4a с возникновением острого коронарного синдрома, в особенности с острым инфарктом миокарда [11]. Кроме того, в 2012 г. китайские ученые в анализе американских пациентов установили связь генотипа 4 а/4 а с повышенным риском ишемического инсульта [12].

Учитывая физиологическую роль еNOS и данные преды­дущих исследований, мы предположили, что изучение частот аллелей гена eNOS у детей с идиопатическим синдромом слабости синусового узла (СССУ) позволит уточнить патогенетические механизмы развития заболевания, а в последующем молекулярно-генетические данные будут полезны для обоснования тактики ведения больных.

Материалы и методы исследования

Обследовано 90 детей с дисфункцией синусового узла (по клинико-электрокардиографическим критериям классификации М. А. Школьниковой). Для верификации диагноза синдрома слабости синусового узла всем детям было проведено клинико-инструментальное обследование: клинический осмотр, электрокардиография на 12-канальном электрокардиографе на аппарате Shiller AG, эхокардиография с цветным допплеровским картированием на аппаратах HDA 5000, Logiq 400, Phillips HD 11, холтеровское мониторирование электрокардиограммы (ЭКГ) в течение 24 ч на аппарате «Schiller mt-200 holter-ecg», атропиновая проба (для исключения вегетативного влияния на сердечный ритм).

Диагноз «идиопатический СССУ» был поставлен 53 детям (58,9 ± 5,2% наблюдаемых).

Критериями включения в группу были: клинически очевидный СССУ, электрокардиографическое подтверждение заболевания, согласие родителей или ребенка старше 13 лет на участие в исследовании. Критерии исключения: вегетативная дисфункция синусового узла, отказ родителей или ребенка старше 13 лет от участия в исследовании.

Медиана возраста пациентов составила 16,0 лет [14,0; 16,0]. В основной группе преобладали мальчики — 45 пациентов (84,9 ± 4,9%), медиана возраста — 16,0 [14,0; 16,0]; в группу вошли 8 девочек (15,1 ± 4,9%), медиана возраста которых составила 15,1 [13,0; 15,0]. Группа сравнения включила 102 здорового ребенка в возрасте 15,0 лет [14,0; 16,0]. Среди них было 90 мальчиков (88,2 ± 3,2%), медиана возраста — 15,0 [15,0; 16,0] и 12 девочек (11,8 ± 3,2%), медиана возраста — 15,0 [14,8; 15,3].

Клинические проявления СССУ у больных включали синкопальные состояния (53 ± 7,1%), головокружения (76,5 ± 6,0%), ощущение перебоев в области сердца (41,2 ± 7,0%), приступы немотивированной слабости (40 ± 6,9%), повышенную утомляемость (37 ± 6,8%), плохую переносимость физических нагрузок (42 ± 7,0%). Всем детям была проведена кардио- и нейрометаболическая терапия, антиоксидантная терапия.

Дети с 1-м, 2-м и 4-м вариантами СССУ получали периферические холинолитики (Беллатаминал по 1 таблетке 2 раза в день курсом не более 6 мес).

Детям с синдромом тахибрадикардии назначалась антиаритмическая терапия — амиодарон в поддерживающей дозе 5 мг/кг/сут длительностью от 3 до 6 месяцев, под контролем функционального состояния щитовидной железы. Двум пациентам с данным вариантом СССУ, с учетом недостаточной эффективности медикаментозного лечения, были имплантированы кардиовертеры-дефибрилляторы, одной девочке был имплантирован электрокардиостимулятор и в течение 5 лет проведены 3 операции радиочастотной аблации. Всем больным с 4-м вариантом СССУ в период от 2 недель после постановки диагноза до 1 месяца была обеспечена постоянная электрокардиостимуляция.

Молекулярно-генетическое исследование у детей с идиопатическим СССУ проводилось в лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний ФГБУ НИИ терапии СО РАМН г. Новосибирска: были взяты образцы крови 155 человек, из которых 53 — дети с идиопатическим СССУ и 102 ребенка группы сравнения. Все родители больных детей и дети, достигшие возраста 14 лет, подписывали форму информированного согласия на исследование. Работа была одобрена на заседании этического комитета КрасГМУ им. В. Ф. Войно-Ясенецкого от 18.01.2011.

Экстракция ДНК из крови осуществлялась методом фенол-хлороформной экстракции [13, 14]. Генотипирование VNTR полиморфизма гена eNOS проводили через амплификацию соответствующего локуса гена и анализ длины продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для ПЦР использовали фланкирующие праймеры 5'-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3' (прямой) и 5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3' (обратный). В случае аллеля b амплифицируется ПЦР-продукт длиной 420 нуклеотидных пар, в случае аллеля a — ПЦР-продукт длиной 393 нуклеотидных пар [15].

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ BIOSTAT 2009. На первом этапе определяли частоты аллелей и генотипов изучаемого гена, затем — соответствие распределения аллелей и генотипов по равновесию Харди–Вайнберга. Описательная статистика исследуемых качественных признаков представлена абсолютными значениями, процентными долями и их стандартными ошибками. Сравнительный анализ частот аллелей и полиморфизмов гена eNOS у больных с СССУ и группой сравнения выполнялся с использованием критерия χ2 с поправкой на непрерывность. Различия оценивали как статистически значимые, начиная со значения p < 0,05.

Для определения связи синдрома слабости синусового узла с одним из генотипов гена eNOS рассчитывалось отношение шансов (ОШ), характеризующее относительный риск развития заболевания у обследуемых с одним из вариантов генотипа, учитывался доверительный интервал отношения шансов (ДИ ОШ):

ОШ = А × С/В × D,

где А — число детей с одним из вариантов генотипа в основной группе; В — число обследуемых с аналогичным вариантом генотипа в группе сравнения; С — число детей основной группы, не имеющих данного варианта генотипа в основной группе; D — число наблюдаемых группы сравнения с другими вариантами генотипа.

Результаты и их обсуждение

По полиморфизму 4a/4b гена eNOS было проведено генотипирование у 53 детей с идиопатическим СССУ и у 102 детей группы сравнения. При использовании закона генетического равновесия Харди–Вайнберга у детей с СССУ было получено 106 аллелей, в группе сравнения — 204.

По результатам полимеразной цепной реакции выявлены 3 вида генотипов eNOS у больных СССУ и лиц группы сравнения: 4a/4а — гомозиготный по аллелю с 4-мя повторами, 4a/4b — гетерозиготный, 4b/4b — по аллелю с 5-ю повторами.

Анализ полученных данных установил, что частота встречаемости носителей аллеля 4a гена eNOS среди детей с СССУ составила 82,1 ± 3,7%, статистически значимо превышая величину аналогичного показателя у здоровых сверстников — 69,6 ± 3,2% (ОШ = 2,00; 95% ДИ ОШ = 1,082–3,723; р = 0,026). Частоты распространения носителей аллеля 4b гена eNOS распределялись следующим образом: дети с СССУ — 17,9 ± 3,7%, у детей группы сравнения — 30,4 ± 3,2% (табл.).

Распределение частот аллелей 4a/4b полиморфизма гена eNOS у детей с идиопатическим СССУ и детей группы сравнения

Частота носителей гомозиготного дикого генотипа 4a/4а среди детей с СССУ составила 66,0 ± 6,5% и была статистически значимо выше, чем у детей группы сравнения — 46,1 ± 4,9% (р = 0,029). Величина отношения шансов составила 2,28, указывая на высокую степень влияния генотипа 4а/4а на риск развития патологии проводящей системы у детей.

Частоты гомозиготного генотипа 4b/4b и гетерозиготного генотипа 4a/4b были примерно одинаковыми у детей обследуемых групп. Так, частота гетерозиготного генотипа 4a/4b у детей с СССУ составила 32,1 ± 6,4%, в группе контроля — 47,0 ± 4,9% (р = 0,212). Частота гомозиготного мутантного генотипа 4b/4b у детей с СССУ — 1,9 ± 1,9%, в группе сравнения — 6,9 ± 2,5% (р = 0,345) (рис.).

Таким образом, у детей с идиопатическим СССУ установлено достоверное преобладание гомозиготного генотипа 4а/4a гена eNOS по сравнению c лицами контрольной группы, что указывает на высокую вероятность развития аритмий, важного критерия синдрома слабости синусового узла.

Распределение частот генотипов 4a/4b гена eNOS у детей с идиопатическим СССУ

Заключение

Проведенное исследование свидетельствует, что изученный генетический маркер может быть использован для выявления предрасположенности к наследственному синдрому слабости синусового узла, подтверждения диагноза и обоснования оперативной тактики ведения больных с целью профилактики неблагоприятных исходов.

Литература

  1. Massion P. B., Feron O., Dessy C. et al. Nitric oxide and cardiac function: ten years after, and continuing // Circ. Res. 2003; 93: 388–398.
  2. Fischmann T. O., Hruza A., Niu X. D. et al. Structural characterization of nitric oxide synthase isoforms reveals striking active-site conservation // Nat. Struct. Biol. 1999; 6 (3): 233–42.
  3. Wang X. L., Mahaney M. C., Sim A. S. et al. Genetic contribution of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene to plasma nitric oxide levels // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1997; 17: 3147–3153.
  4. Ziolo M. T., Bers D. M. The real estate of NOS signaling: location, location, location // Circ. Res. 2003; 92: 1279–1281.
  5. Charles I. G., Palmer R. M., Hickery M. S. et al. Cloning, characterization and expression of a cDNA encoding an inducible nitric oxide synthase from the human chondrocyte // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 11419–11423.
  6. Forstermann U., Closs E. I., Pollock J. S. et al. Nitric oxide synthase isozymes: characterization, purification, molecular cloning, and functions // Hypertension. 1994; 23: 1121–1131.
  7. Forstermann U., Munzel T. Endothelial Nitric Oxide Synthase in Vascular Disease: From Marvel to Menace // Circulation. 2006; 113: 1708–1714.
  8. Wang H., Kohr M. J., Wheeler D. G. et al. Endothelial nitric oxide synthase decreases β-adrenergic responsiveness via inhibition of the L-type Ca2+ current // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2008; 294: 1473–1480.
  9. Veldman B. A., Spiering W., Doevendans P. A. et al. The Glu298 Asp polymorphisms of the NOS3 gene as a determinant of the baseline production of nitric oxide // J. Hypertens. 2002; 20: 2023–2027.
  10. Nakayama M., Yasue H., Yoshimura M. et al. T-786 C mutation in the 5′-flanking region of the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm // Circulation. 1999; 99: 2864–2870.
  11. Fatini C., Sofi F., Sticchi E. et al. Influence of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms (G894T, 4a4b, T-786 C) and hyperhomocysteinemia on the predisposition to acute coronary syndromes // Am. Heart. 2004; 147: 516–521.
  12. Tong Y., Yin X., Wang Z. et al. A tailed primers protocol to identify the association of eNOS gene variable number of tandem repeats polymorphism with ischemic stroke in Chinese Han population by capillary electrophoresis // Gene. 2013; 517 (2): 218–223.
  13. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory. Cold Spring Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
  14. Smith C. L., Kalco S. R. Cantor C. R. Pulsed field gel electrophoresis and the technology of large DNA molecules. In: Davis R. E., Ed. Genome analysis. Washington: IRL Press; 1988.
  15. Zhang R., Min W., Sessa W. C. Functional analysis of the human endothelial nitric oxide synthase promoter. Sp1 and GATA factors are necessary for basal transcription in endothelial cells // J. Biol. Chem. 1995; 270: 15320–15326.

Е. В. Анциферова*, 1
С. Ю. Никулина*,
доктор медицинских наук, профессор
Е. Ю. Емельянчик*, доктор медицинских наук, профессор
Л. Н. Анциферова**
В. Н. Максимов***,
доктор медицинских наук
Е. П. Кириллова*, кандидат медицинских наук
А. А. Чернова*, кандидат медицинских наук
Н. В. Зайцев*
А. Ю. Мишута**

* ГБОУ ВПО КрасГМУ им. В. Ф. Войно-Ясенецкого МЗ РФ, Красноярск
** КГБУЗ КККДБ, Красноярск
*** ФГБГУ НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск

1 Контактная информация: Anciferova_ekate@mail.ru


Купить номер с этой статьей в pdf


Еженедельный дайджест "Лечащего врача": главные новости медицины в одной рассылке

Подписывайтесь на нашу email рассылку и оставайтесь в курсе самых важных медицинских событий


поле обязательно для заполнения
поле обязательно для заполнения
поле обязательно для заполнения
поле обязательно для заполнения
Нажимая на кнопку Подписаться, вы даете согласие на обработку персональных данных

Актуальные проблемы

Специализации




Календарь событий:




Вход на сайт