Преимущества мРНК-вакцин против инфекционных заболеваний

Преимущества мРНК-вакцин против инфекционных заболеваний

Cuiling Zhang, Giulietta Maruggi, Hu Shan, Junwei Li

Перевод из журнала Frontiers in Immunology (оригинал).

Опубликовано 27 марта 2019 г.

Аннотация

На протяжении двух последних десятилетий пристальное внимание привлекают технологии на основе РНК, используемые для создания профилактических и терапевтических вакцин. Доклинические и клинические испытания показали, что мРНК-вакцины обеспечивают безопасный и длительный иммунный ответ как на животных моделях, так и у людей. В данном обзоре мы суммируем текущую информацию о научном прогрессе в области мРНК-вакцин, которые могут быть быстро разработаны и стать мощным оружием против инфекционных заболеваний, а также подчеркиваем, что создание и применение таких вакцин ожидает большое будущее.

Введение

Вакцинация представляет собой наиболее успешный медицинский подход к профилактике и контролю заболеваний. Успешная разработка и применение вакцин уже спасли тысячи жизней и огромное количество денежных средств. В будущем вакцины смогут применяться не только против инфекционных заболеваний, но также и против рака в качестве средств профилактики и лечения, а также для элиминации аллергенов [1-3]. До 1980-х гг. вакцины разрабатывались с целью защиты от микроорганизмов. Опытным путем получали инактивированные вакцины либо методом нагревания, либо химической обработкой, а также получали живые аттенуированные вакцины, главным образом с использованием животных, клеточных линий или неблагоприятных для роста условий. В ходе разработки вакцины механизмы, вовлеченные в процесс иммунизации, оставались неизвестными. Тем не менее, использование живых аттенуированных вакцин или убитых цельноклеточных вакцин имело колоссальный успех для контроля и эрадикации ряда тяжелых инфекционных заболеваний человека, включая натуральную оспу, полиомиелит, корь, паротит, краснуху, а также инфекционных заболеваний животных, таких как классическая чума свиней, чума рогатого скота и инфекционная анемия лошадей. В последнее время благодаря успехам в теории и практике молекулярной биологии были разработаны живые аттенуированные (LAV), субъединичные и пептидные вакцины. Результаты, полученные при вакцинации живыми ослабленными вакцинами, очень сильно расширили наши представления о механизмах, связанных с иммунным ответом, вызванным этими вакцинами. В случае инактивированных вакцин главный вклад в профилактику и контроль инфекционных заболевания, вызванных микроорганизмами, вносят антиген-специфичные антитела. LAV вызывают сильный клеточный иммунный ответ, который имеет решающее значение для эрадикации многих внутриклеточных патогенов. Тем не менее, неудачи, которые иногда случаются при использовании инактивированных вакцин, объясняются мутацией поверхностных антигенов патогена. Дополнительные вопросы о применении LAV включают их способность вызывать заболевание у лиц с ослабленным иммунитетом, а также возможность возврата к вирулентной форме из-за обратной мутации, приобретения компенсаторных мутаций или рекомбинации с циркулирующими передаваемыми штаммами дикого типа [4, 5]. Тем не менее, субъединичные и пептидные вакцины менее эффективны для вызывания устойчивого CD8+ иммунного ответа, который важен в случае внутриклеточных патогенов, включая вирусы и некоторые бактерии [6, 7].
Использование вакцин на основе нуклеиновых кислот с невирусной доставкой против имитаторов инфекций или иммунизация живыми микроорганизмами стимулирует возможности фолликулярного Т-хелпера и иммунный ответ зародышевой B-клетки [8, 9]. Более того, производство вакцины на основе нуклеиновых кислот с невирусной доставкой безопасно и экономно с точки зрения времени, не дает роста высокопатогенных организмов в большом масштабе, а также менее рискованно в смысле загрязнения живыми инфекционными агентами и утечки опасных патогенов. Следует заметить, что наибольшую трудность представляет получение нужного запаса за короткое время [10].   Вакцины на основе нуклеиновых кислот с невирусной доставкой могут удовлетворить потребность в вакцинах против эпидемических заболеваний [10].  Нуклеиновые кислоты с невирусной доставкой подразделяются на ДНК- и РНК- в соответствии со своим типом сахарида, содержащего 5 атомов углерода. ДНК-вакцины и РНК-вакцины действуют по-разному. На этапах между иммунизацией при помощи ДНК-матрицы и экспрессией целевого антигена, ДНК должна преодолеть цитоплазматическую мембрану и оболочку ядра клетки, быть транскрибирована в мРНК и переместиться обратно в цитоплазму для инициации трансляции (Рис. 1). Несмотря на то, что ДНК-вакцины имеют многообещающие свойства и характеризуются доказанными безопасностью, переносимостью и иммуногенностью, по данным ранних клинических испытаний, они имеют неоптимальную специфическую активность [11]. Улучшенные технологии доставки, такие как электропорация, повышали эффективность ДНК-вакцин у человека [12], но не уменьшали возможный риск интеграции чужеродной ДНК в геном хозяина, что может вызвать тяжелые мутации и новые заболевания [13, 14]. После того, как было обнаружено, что депротеинизированная ДНК, in vitro транскрибированная в мРНК, может быть экспрессирована in vivo после прямой инъекции в мышцу мыши, мРНК стала широко изучаться в качестве основы для профилактики и терапии [15-19]. Для сравнения, мРНК-вакцины обладают рядом преимуществ относительно вакцин на основе вирусного вектора и ДНК-вакцин (суммировано в Табл. 1). Использование РНК в качестве терапевтического инструмента не находится в фокусе внимания данной работы и широко представлено в других источниках [2, 19, 20]. В данном обзоре мы представляем мРНК-вакцины как многообещающее средство профилактики и контроля инфекционного заболевания.

Рисунок 1. Механизмы различных НК-вакцин (в том числе РНК и ДНК). ГКГС - главный комплекс гистосовместимости

Таблица 1. Преимущества и недостатки вирусных вакцин, ДНК- и РНК-вакцин

Концепция и виды мРНК-вакцин

Впервые о том, что мРНК-вакцины эффективны для прямого переноса генов, сообщили Woff и соавт. [15]. В настоящее время разработаны два вида мРНК-вакцин: обычные мРНК-вакцины и самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины, полученные из положительной цепи РНК вирусов. Хотя мРНК-вакцины впервые испытывались в начале 1990-х гг., сперва они не применялись широко по причине опасений, связанных с их ненадежной стабильностью, обусловленной повсеместным присутствием рибонуклеаз, а также из-за малых масштабов производства. Ross и соавт. в 1995 г. впервые продемонстрировали, что стабильность мРНК может быть повышена путем оптимизации и подбора состава препарата [25]. С этого момента начался быстрый прогресс в исследованиях мРНК-вакцин, в настоящее мРНК можно производить синтетическим путем посредством внеклеточной реакции ферментативной транскрипции. Реакция транскрипции in vitro включает в качестве основных компонентов линеаризованную плазмидную ДНК, кодирующую мРНК-вакцину, в качестве шаблона, рекомбинантную РНК-полимеразу и нуклеозидтрифосфаты. Кэп-структура ферментативно добавляется к продукту транскрипции в конце реакции, или как синтетический аналог кэпа при одноэтапной процедуре. В завершение получают поли(А)-хвост для образования зрелой мРНК-последовательности.
Обычные мРНК-вакцины включают в самом простом своем варианте открытую рамку считывания для целевого антигена, защищенную по краям нетранскрибируемыми участками (UTRs), а также с концевым поли(А)-хвостом. После трансфекции они управляют транзиторной экспрессией антигена. Дополнительно к обычным вакцинам существует другая  основа мРНК-вакцин, базирующаяся на геноме положительной цепи вирусов, обычно альфа-вирусов. Эти мРНК-вакцины основаны на сконструированном вирусном геноме, содержащем гены, кодирующие механизм репликации РНК, тогда как последовательности структурных белков заменены представляющим интерес геном (GoI), полученные в результате геномы называют репликонами. Эти вакцины получили название самоамплифицирующихся мРНК-вакцин, и их саморепликацией можно управлять посредством синтеза РНК-зависимого РНК-полимеразного комплекса, генерирующего множество копий антиген-кодирующей мРНК, и они экспрессируют высокие уровни гетерологичного гена при введении в цитоплазму клетки хозяина, имитируя продукцию антигенов in vivo вирусными патогенами, запуская как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ [22-27]. Самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины могут быть получены из сконструированных геномов вируса Синдбис, вируса леса Семлики, вируса Кунджин и других [28-30]. Самоамплифицирующиеся мРНК (~9-11 т.п.н.) получают из матричной ДНК при помощи процедур, похожих на описанные ранее для обычных молекул мРНК и РНК, которые можно получать в большом масштабе in vitro. После того, как очищенный РНК-репликон доставлен в клетку хозяина, либо в виде частиц вируса, либо в виде синтетически сконструированной РНК, он широко транслируется и амплифицируется путем кодирования РНК-зависимой РНК-полимеразой. Опубликованные результаты показали, что, по сравнению с быстрой экспрессией обычных мРНК, вакцинация самоамплифицирующимися мРНК-вакцинами дает более высокие уровни экспрессии антигена, хотя и позже по времени, in vivo задержка достигает нескольких дней. Эквивалентная защита достигается, однако, при гораздо меньшей дозе РНК [31]. Из-за нехватки вирусных структурных белков репликон не производит инфекционных частиц вируса. Кроме того, как обычная мРНК, так и самоамплифицирующиеся мРНК, не могут встраиваться в геном хозяина и естественным образом разлагаются в процессе экспрессии антигенов. Эти характеристики показывают, что мРНК-вакцины способны стать намного безопаснее других вакцин, а также являются многообещающей платформой для вакцинации.

Сконструированная мРНК с потенциальной эффективностью

Стабильность и трансляция мРНК имеют решающее значение для создания успешной РНК-вакцины [32, 33]. В процессе трансляции чистота мРНК определяет ее стабильность и выход белка [34]. Загрязнение дцРНК, получающимися из-за побочной полимеразной активности РНК, приводит к ингибированию трансляции и к деградации клеточной мРНК и рибосомной РНК, тем самым снижая экспрессию белка из-за прерывания механизма трансляции. Удаление дцРНК может значительно увеличить трансляцию [35]. Избыток компонентов, а также короткие и двухцепочечные РНК (дцРНК), могут быть удалены очисткой. Изначально для этой цели использовался хлорид лития (LiCl), однако его применение ограничено переходом на промышленное производство мРНК-вакцин, кроме того, он не удаляет дцРНК. Для удаления любых оставшихся продуктов при производстве мРНК в большом масштабе, а также для реализации процессов согласно правилам организации производства и контроля качества лекарственных средств, может быть использована очистка при помощи жидкостной экспресс-хроматографии белков или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [35-37]. Некодирующие 5′-фланкирующие и 3′-концевые последовательности открытой рамки считывания имеют определяющее значение для трансляции. 5′-нетранслируемая область, такая как последовательность Козака, или 5′-кэпы необходимы для эффективного продуцирования белка [38-40].  3′-нетранслируемая область, содержащая оптимальный поли(А)-сигнал, определяла стабильность мРНК и увеличивала трансляцию белка [41-45]. Дополнительно, кодон оптимизации является популярным методом для того, чтобы избежать редких кодонов с низким коэффициентом использования, для увеличения продуцирования белка, содержания мРНК и стабильности [46-49].
мРНК вакцины эффективны при экспрессии антигена, но последовательность и вторичные структуры, образуемые мРНК, распознаются рядом естественных иммунных рецепторов, и это распознавание может подавлять трансляцию белка. Благодаря развитию понимания биологии РНК появилось несколько методов, которые могут использоваться для увеличения эффективности мРНК-вакцин, включая оптимизацию последовательности и применение модифицированных нуклеозидов. Распознавания естественными иммунными сенсорами можно избежать путем введения модифицированных нуклеозидов, таких как псевдоуридин (Ψ), 5-метилцитидин (5 mC), в структуру кэп-1 и оптимизированные кодоны, которые, в свою очередь, улучшают эффективность трансляции [50-55]. В течение транскрипции мРНК in vitro незрелая мРНК может образовываться как примесь, ингибирующая трансляцию путем стимулирования естественной иммунной активации. Очистка при помощи жидкостной экспресс-хроматографии белков и ВЭЖХ разрешает эту проблему [35, 37].
В настоящее время большинство применяемых вакцин, за исключением некоторых вакцин для животных, требуют транспортировки и хранения в условиях непрерывной холодовой цепи, которая легко нарушается, особенно в бедных сельскохозяйственных регионах тропических стран; этим требованиям не отвечают доступные эффективные вакцины для профилактики и контроля инфекционных заболеваний. По этой причине разработка термостойких вакцин представляет большой интерес.
Оптимизация состава синтетических мРНК-вакцин показала, что получить термостабильные вакцины можно. Результаты, представленные Jones, показали, что сублимированная мРНК с трегалозой или депротеинизированная мРНК стабильна по меньшей мере в течение 10 мес. при температуре 4 0С. После трансфицирования эти мРНК экспрессировали высокие уровни белков и обеспечивали высокоэффективный и длительный иммунитет на новорожденных и пожилых животных моделях [56]. Другая лиофилизированная мРНК-вакцина продемонстрировала стабильность при температуре 5-25 0С в течение 36 месяцев и при 40  0С в течение 6 месяцев [57]. Stitz и соавт. показали, что когда протамин-инкапсулированная вакцина от вируса бешенства на основе обычной мРНК была подвергнута колебаниям температуры в интервале от 4 до 56 0С в течение 20 циклов и действию температуры 70 0С, ее иммуногенность и защитное действие не пострадали [58]. Инкапсулирование мРНК в катионную липосому или проникающий пептид (CPP) предохраняло мРНК от разложения  рибонуклеазой. Эти интересные применения будут обсуждаться в разделе, посвященном методам доставки.

РНК-вакцины для профилактики инфекционных заболеваний

На протяжении последних двух десятилетий широко исследовались мРНК-вакцины для профилактики инфекционных заболеваний, а также для профилактики и лечения рака. К настоящему моменту достигнуты значительные успехи [19, 20]. Были созданы мРНК-вакцины от рака, предназначенные для экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов, которые стимулируют клеточно-опосредованный иммунный ответ с целью уничтожения или подавления раковых клеток [59]. Большинство изученных вакцин от рака являются в большей степени терапевтическими, чем профилактическими, и они рассмотрены в ряде источников [20, 60, 61]. мРНК-вакцины против инфекционных заболеваний могут быть профилактическими и терапевтическими. мРНК-вакцины, экспрессирующие антиген инфекционного патогена, вызывают сильный Т-клеточный и гуморальный иммунный ответ [8, 16, 19]. Как описано выше, процесс производства мРНК-вакцин полностью внеклеточный, простой и быстрый по сравнению с получением целых микробных, живых аттенуированных или субъединичных вакцин. Этот быстрый и простой процесс производства делает мРНК многообещающим биопродуктом, который может удовлетворить потребность в вакцинах против новыхинфекционных заболеваний. Производство РНК в широком масштабе, удовлетворяющим нужды промышленного производства, – это первый шаг к созданию мРНК-вакцин. В настоящее время все компоненты, необходимые для производства мРНК, доступны, и их качество соответствует стандартам GMP; однако некоторые компоненты поставляются в ограниченном количестве. На первом этапе было проведено большое количество исследований по разработке мРНК-вакцин против рака, и они показали осуществимость производства транскрибированной in vitro РНК для клинического применения [60]. Было проведено несколько проектов по мРНК-вакцинам против инфекционных заболеваний, хотя клиническая оценка все еще остается ограниченной. Например, несколько платформ для вакцин на основе РНК были использованы для разработки вакцин против гриппа. Некоторые опубликованные результаты показали, что вакцины против гриппа на основе РНК вызывают широкий защитный иммунный ответ не только против гомологичных, но и против гетеро-субтипических вирусов гриппа [62-66]. мРНК-вакцины против гриппа дают большие надежды, поскольку они сделаны на платформе без использования куриных эмбрионов, и лидируют по производству антигена в клетках млекопитающих. Недавно опубликованные результаты демонстрируют, что потеря центра гликозилирования из-за мутации в гемаггютинине (HA) адаптированной к куриному эмбриону штамму вакцины против H3N2 приводило к слабой нейтрализации циркулирующих варусов H3N2 у вакцинированных людей и хорьков. Напротив, процесс производства мРНК-вакцины осуществляется без использования куриных эмбрионов, и кодируемые мРНК белки имеют нужную структуру и гликозилированы в клетках хозяина после вакцинации, что, таким образом, устраняет риск производства неправильных антигенов [67, 68].
мРНК также используется в ветеринарии для профилактики инфекционных заболеваний у животных. Pulido и соавт. показали, что иммунизация при помощи транскрибированной in vitro мРНК обеспечивала у мышей защиту против энтеровирусного везикулярного стоматита [69].  Saxena и соавт. продемонстрировали, что самоамплифицирующаяся мРНК-вакцина, кодирующая гликопротеин вируса бешенства, вызвала иммунный ответ и обеспечила защиту у мышей, и потенциально может использоваться для профилактики бешенства у собак [70]. Недавно VanBlargan и соавт. разработали инкапсулированную в липидные наночастицы (ЛНЧ) модифицированную мРНК-вакцину, кодирующую гены prM и E вируса Повассан (POWV). Эта мРНК-вакцина вызывала сильный гуморальный иммунный ответ не только против штаммов POWV, но и против эволюционно далекого вируса Лангат [71]. Как описано ранее, модификация нуклеозидов и оптимизация кодонов может помочь избежать распознавания естественными иммунными сенсорами и улучшить эффективность трансляции. В Таблице 2 приведены данные исследований, проведенные на мРНК-вакцинах против инфекционных заболеваний, полученных с использованием модифицированных и не модифицированных нуклеозидов [52, 58, 72-78].

Таблица 2. Нуклеозид-модифицированные или немодифицированные мРНК-вакцины против инфекционных заболеваний.

Кроме использования в качестве вакцины, мРНК может применяться в терапевтических целях. Интересно, что недавняя публикация Pardi и соавт. показала, что применение мРНК, кодирующей легкие и тяжелые цепи нейтрализующего антитела широкого спектра действия против ВИЧ, инкапсулированной в липидные наночастицы (ЛНЧ), защищало гуманизированных мышей от внутривенно введенного ВИЧ [79]. Эти данные предполагают, что использование мРНК с модифицированными нуклеозидами может быть расширено на пассивную иммунотерапию против ВИЧ, цитомегаловируса (ЦМВ), вируса папилломы человека и т. д. Самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины способны обеспечивать раннюю экспрессию антигенов и вызывать Т-клеточный иммунный ответ. В таблице 3 мы собрали публикации, посвященные самоамплифицирующимся мРНК-вакцинам против инфекционных заболеваний, доставляемых в виде частиц вирусных репликонов или в виде синтетических мРНК [80, 82-85, 87, 91, 92].

Таблица 3. Самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины против инфекционных заболеваний

Путь доставки и состав мРНК-вакцин

Путь введения и рецептура мРНК-вакцин имеют решающее значение для определения кинетики и величины экспрессии антигена, а также силы иммунного ответа. Например, внутривенное введение немодифицированной депротеинизированной мРНК приводило к быстрому ее расщеплению рибонуклеазами и стимулированию естественного иммунного ответа, но эти ограничения могут быть преодолены при помощи подходящих систем доставки и модификации мРНК [93]. мРНК-вакцины применяют системным или локальным методом, основанном на требованиях к локализации экспрессии антигена. Прямая внутримышечная (в/м), внутрикожная (в/к) или подкожная инъекция транскрибированной in vitro мРНК — это основные пути доставки для мРНК-вакцин против инфекционных заболеваний, тогда как внутрибрюшинное (в/б) и внутривенное (в/в) применение используются тогда, когда требуется системная экспрессия нужных антигенов, главным образом при терапевтическом применении. В недавнее время было опубликовано большое количество работ, где показано, что разнообразные антигены могут быть экспрессированы с высокой эффективностью и вызывать сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ после вакцинации с использованием мРНК. Например, для исследования влияния пути введения на кинетику экспрессии антигена использовались липидные наночастицы (ЛНЧ), заполненные обычной мРНК с модифицированными нуклеозидами, кодирующей люциферазу светлячка [94]. В/м и в/к введение обеспечивало наилучший уровень и длительность эффекта, продукция белка достигала максимума через 4 часа и поддерживалась локально в течение 8-10 дней посте инъекции, в зависимости от дозы. Как в/м, так и в/к введение макакам-резусам обычной мРНК с модифицированными нуклеозидами, кодирующей грипп H10, инкапсулированной в ЛНЧ, вызывало защитный титр, но этот ответ быстрее достигался при внутрикожном введении, чем при внутримышечном [95].
CV7201 это кандидат в мРНК-вакцины, находящийся в стадии исследований в CureVac AG. в/м и в/к введение CV7201 у мышей и свиней вызывало сильный гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ [77]. В фазе I клинических испытаний CV7201 продемонстрирована долгосрочную безопасность и иммуногенность против вируса бешенства при низкой дозе. Относительно безопасности, не наблюдалось никаких отличий между в/м и в/к введением или между использованием шприц-ручки или безыгольной инъекции CV7201. Однако, когда были оценены титры нейтрализующего антитела, индуцированного CV7201, безыгольная инъекция оказалась предпочтительнее использования шприц-ручки [57]. При испытании вакцины против гриппа введение внутрь лимфоузла (в/у) депротеинизированной мРНК вызывало сильный CD4 и CD8 Т-клеточный иммунный ответ у мышей, и повторение в/у инъекции модифицированной мРНК приводило к примированию антиген-специфичных CD4 и CD8 Т-клеток, тогда как подкожное в/к введение не приводило [96]. Сочетание двух и более способов доставки исследовалось и применялось при разработке противораковой мРНК-вакцины. Сочетание в/в и в/к инъекций TriMix-DC-MEL продемонстрировало благоприятный долгосрочный результат у пациентов с широким CD8 и CD4 Т-клеточным иммунным ответом [97]. Дальнейшие исследования показали, что в/у и внутриопухолевое введение TriMix мРНК в дендритные клетки давало лучший терапевтический долгосрочный результат, чем введение в другие места [98, 99]. Однако, в/к введение РНК-активных вакцин показало иммунный ответ, близкий к достигаемому при в/у применении обычных мРНК-вакцин, что является противоречивым результатом [100]. В общей сложности, эти результаты подчеркивают важность пути доставки для эффективности мРНК-вакцин.
Аналогично, Fleeton и соавт. показали, что в/м инъекция транскрибированнной in vitro депротеинизированной самоамплифицируемой мРНК-вакцины на основе генома вируса леса Семлики может вызывать защитный иммунный ответ [62]. Geall и соавт. показали, что в/м введение у мышей и хлопковых хомяков очень низкой дозы самоамплифицирующейся мРНК, кодирующей F-белок респираторно-синцитиального вируса (RSV), инкапсулированной в синтетические ЛНЧ, приводило к очень высоким титрам IgG1 и интерферон (IFN)-продуцирующих CD4 и CD8 Т-клеток [22].
Инструменты для доставки столь же важны для эффективности мРНК-вакцин. В идеале система доставки должна защищать РНК от возможного разложения рибонуклеазой и обеспечивать эффективное поглощение клеткой-мишенью, легкое высвобождение РНК из системы и выход из эндосомы. Преодоление барьера цитоплазматической мембраны и избежание разложения рибонуклеазами – это начальные шаги к эффективной доставке РНК в клетку-мишень. Конечные важные требования к оптимальной системе доставки это отсутствие как токсичности, так и стимуляции иммунитета. На начальных этапах синтезированная in vitro мРНК напрямую вводилась животным с помощью инъекций. Позже подтвердилось, что мРНК-вакцины, помещенные в липосомы, вызывают вирус-специфичный противогриппозный цитотоксический Т-лимфоцитарный (CTL) иммунный ответ у мышей [72]. Несколько методов использовались для увеличения эффективности доставки, и очень большой прогресс был достигнут в области конструирования РНК-вакцин с системой доставки [101-103]. Дополнительно к физическим методам генной пушки и электропорации, мРНК-вакцины доставляли в цитоплазму при помощи катионных липидов и полимеров. Было также показано, что мРНК в виде катионной наноэмульсии тоже вызывает сильный иммунный ответ [8, 23, 85]. Однако, некоторые из этих систем доставки продемонстрировали токсичность in vivo, что ограничивает их применение у людей [104]. Новые платформы для использования в качестве средств транспорта для мРНК-вакцин были разработаны с целью избежать ограничения из-за токсичных агентов химической трансфекции. Большинство этих платформ использовали ЛНЧ на основе катионного липида или липидных полимеров. ЛНЧ облегчают доставку РНК и сильно увеличивают экспрессию антигена. Некоторые группы использовали липиды или полимеры в качестве платформ для доставки мРНК-вакцин против  ВИЧ-1 подкожным способом, что эффективно вызывало ВИЧ-специфичный CD4 и CD8 Т-клеточный ответ, или интраназальным способом, что вызывало антиген-специфичный иммунный ответ [73, 105, 106]. мРНК участка гена вируса гриппа HA, инкапсулированная в липид, также была изучена, и было показано, что однократное введение вызывает активацию Т-клеток [107]. Сочетание ЛНЧ-технологии с модификацией нуклеозидов увеличивает эффективность мРНК-вакцин. Модифицированная мРНК вируса гриппа HA из H10N8 и H7N9, помещенная в ЛНЧ, вызывала сильный защитный иммунный ответ у мышей, хорьков и яванских макак [108].
Другая цель, против которой ЛНЧ-доставка мРНК показала очень высокий потенциал, это вирус Зика. Не существует вакцины, способной предотвратить это переносимое комарами заболевание, и недавняя эпидемия вызвала беспокойство во всем мире. Richner  и соавт. сообщили, что две вакцины с модифицированной мРНК, кодирующей редактированный prM-E-ген или ген дикого типа, инкапсулированной в ЛНЧ, вызывали высокий порядок титра нейтрализующего антитела [57, 109].
Вакцины на основе модифицированной мРНК, созданные с использованием ЛНЧ, также обеспечивали сильный иммунный ответ и защищали морских свинок от заболевания, вызываемого вирусом Эбола [52]. Внутривенное введение модифицированной мРНК, инкапсулированной в ЛНЧ, продемонстрировала максимальную экспрессию белков через 6 часов после введения [110]. Как в/к, так и в/м введение нерепликационной мРНК, кодирующей вирус гриппа H10, инкапсулированной в ЛНЧ, давало высокие защитные титры, но этот ответ наступал быстрее при в/к введении по сравнению с в/м Введением [95].
ЛНЧ являются популярным средством доставки для вакцин на основе самоамплифицирующейся мРНК. Множество исследований показали, что самоамплифицирующаяся мРНК, инкапсулированная в ЛНЧ, вызывала сильный клеточный и гуморальный иммунный ответ при разных путях введения [19, 107, 111]. Самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины с ЛНЧ в составе, кодирующие антигены вируса гриппа, приводили к сильному Т- и В-клеточному иммунному ответу и обеспечивали защиту против заражения гомологичным и гетерогогичным вирусами гриппа [63, 65, 112].
Проникающие пептиды (CPP), вид катионных пептидов, представляют собой многообещающий инструмент для доставки мРНК к внутриклеточным целям. Протамин – это обогащенный аргинином катионный пептид, который может связываться с мРНК и транспортировать ее в цитоплазму. Протамин широко изучался в качестве системы доставки для мРНК-вакцин против рака и вирусов. С применением протамина была создана платформа для самоамплифицирующейся вакцины на основе активированной мРНК, и были продемонстрированы ее возможности против различных инфекционных заболеваний и рака [76, 77, 100]. Недавно Coolen и соавт. сконструировали инновационную платформу для доставки, состоящую из полимолочной кислоты и катионных проникающих пептидов в качестве агента, конденсирующего мРНК. Эти нанокомплексы были поглощены дендритными клетками, и это вызвало сильную экспрессию белков и естественный иммунный ответ [113].
Самоамплифицирующаяся мРНК, кодирующая HA [A/California/ 07/2009(H1N1)], инкапсулированная в наноэмульсию масло-в-воде, стимулировала защиту против гомологичного и гетерологичного вируса гриппа [65]. Использование полиэтиленимина (PEI) в составе с самоамплифицирующейся мРНК, кодирующей H1N1/PR8-HA, приводило к значительно более высокому титру антитела и к более длительной устойчивой экспрессии антигена, чем применение просто самоамплифицирующейся мРНК [31, 114]. Хитозан и PEI использовались для доставки самоамплифицирующейся мРНК и в виде наночастиц [114, 115]. Chahal и соавт. разработали интересную платформу, состоящую из химически модифицированной дендримерной наночастицы, конденсирующей самоамплифицирующуюся мРНК, кодирующую грипп HA. Однократная иммунизация мышей вызывала сильный CD8+ Т-клеточный и гуморальный ответ и защищала мышей против заражения широким спектром летальных патогенов, включая грипп H1N1, Toxoplasma gondii и вирус Эбола [64].
В настоящее время исследуются и другие новые наночастицы, такие как полиплексы, наноплексы, а также доставка с помощью пористых каркасных полимеров [116-122]. Хотя в области разработки средств доставки достигнуты очень большие успехи, возможно, идеальной платформой будет сочетание различных средств доставки мРНК, а также потребуются еще большие усилия в направлении понимания механизма действия.

Механизм иммунного ответа, вызванного мРНК-вакцинами

Механизм иммунного ответа, вызванного мРНК, требует изучения. Процесс распознавания мРНК-вакцины клеточными сенсорами и механизм активации сенсоров все еще остается невыясненным. Внутри клеток обнаружены два типа РНК-сенсоров, эндосомальные толл-подобные рецепторы (TLR) и семейство RIG-I-подобных рецепторов. Первая группа подразделяется на TLR-3, TLR-7, TLR-8 и TLR-9, которые расположены в эндосомальном компартменте специальзированных клеток иммунного надзора, таких как дендритные клетки (ДК), макрофаги и моноциты. TLR-3 распознают дцРНК длиной более 45 пар оснований, а также дцРНК, получающуюся из одноцепочечной РНК (оцРНК), образующей вторичные структуры, или полученную из промежуточных продуктов репликации вируса.  TLR-7 и TLR-8 активируются РНК, богатыми полиуридинами, гуанозинами и/или уридинами. TLR-7 могут связывать как дцРНК, так и оцРНК, тогда как TLR-8 распознает только оцРНК [123]. Активация TLR-7 может увеличивать презентацию антигена, способствовать выработке цитокина и стимулировать В-клеточный ответ [124]. Последнее семейство, действуя как паттерн-распознающий рецептор (PRR), включает в себя RIG-I, MDA5 и LGP2 [125].  RIG-I преимущественно распознает оцРНК и дцРНК, несущие 5'-трифосфат, и стимулирует продукцию интерферона [126-130]. Структура "сковорода с ручкой" в участках генома вируса была непосредственно вовлечена в индукцию интерферона через активацию RIG-I [131]. MDA5 представляет собой другой цитозольный РНК-сенсор, который обнаруживает длинную дцРНК, полученную во время репликации РНК-содержащего вируса [132], а также РНК синтетического происхождения, включая сополимер полиинозиновой и полицитидиловой кислот. Распознавание при помощи дцРНК вызывает активацию IRF3 и NF-κB, впоследствии приводящую к увеличению продукции интерферона I типа [127, 133, 134]. Иногда элементы дцРНК, распознанные сенсорами паттерн-распознающего рецептора, могут действовать как адъювант при индукции интерферона [135-137]. мРНК-вакцины могут стимулировать естественный иммунитет через TLR-3, TLR-7, TLR-8, RIG-I b MDA5 [138, 139]. Индукция интерферона, вызванная мРНК-вакцинами через РНК-сенсоры, зависит от качества транскрибированной in vitro мРНК, системы доставки и способа применения. мРНК, воспринимаемая естественной иммунной системой, это обоюдоострое оружие при элиминации поступающих молекул. Природная экзогенная мРНК стимулирует сильную индукцию интерферонов типа I и сильных воспалительных цитокинов, которые вызывают Т- и В-иммунный ответ, но могут отрицательно сказаться на экспрессии антигенов [140-143]. Интересно, что Blanchard и соавт. разработали метод измерения активации паттерн-распознающего рецептора IVT мРНК в клетках и в срезе ткани. В этом подходе использовались методы близкого лигирования (PLA) [144].
В/к вакцинация с использованием технологий вакцин на основе активной РНК, разработанных CureVac AG, вызывала сильный иммунный ответ, который зависел от TLR-7-сигнала. Активация TLR-7 приводит к повышению экспрессии хемокинов, которые в свою очередь привлекают к месту инфицирования естественные иммунные клетки, такие как ДК и макрофаги [100]. В месте инфицирования наблюдалась активация провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-α и ИЛ-6, которые, как известно, вносят вклад в привлечение иммунных клеток [145].
С другой стороны, раннее прекращение экспрессии антигена после вакцинации мРНК из-за активации PRR должно быть неблагоприятно.
Соответственно экспрессия антигена, гуморальный и Т-клеточный ответ на вакцинацию мРНК, как при применении обычной, так и самоамплифицирующейся мРНК, были значительно увеличены у мышей IFNAR1/2 −/− [105, 146] или при совместном применении антагониста интерферона [147]. Отрицательное воздействие избыточной активации интерферона может возникать не только из-за предотвращения амплификации РНК (в случае самоамплифицирующихся мРНК-вакцин) и экспрессии, но и от уровня Т-клеток. Поскольку интерферон типа I может определять дифференциацию антиген-примированых CD8+ Т-клеток в цитотоксические эффекторы, они могут также способствовать истощению Т-клеток [140]. Будет ли интерферон типа I подавлять или стимулировать CD8 Т-клеточный ответ на мРНК-вакцины, должно зависеть от времени и интенсивности индуцированного интерферона типа I [140]. Ингибирование Т-клеток превалирует, если включение рецепторов интерферона типа I опережает включение рецепторов Т-клеток.
Модифицированная мРНК с псевдоуридинами и мРНК, очищенная методом ВЭЖХ, могут уменьшить иммунную активацию и увеличить стабильность и экспрессию антигена [35, 148, 149]. Например, в/б инъекция мРНК, содержащей псевдоуридины, вызывала экспрессию антигенов без индукции цитокинов у мышей [150]. Кроме этого, в некоторых публикациях было показано, что чистота и системы доставки влияют на иммунный ответ, вызываемый мРНК [35]. Недавние исследования показали, что модифицированная мРНК, инкапсулированная в ЛНЧ, оказывает эффект адъюванта и вызывает сильный ответ фолликулярных Т-хелперов, а также большое количество зародышевых центров В-клеток с долгоживущими высокоаффинными нейтрализующими антителами [78].
Созревание дендритных клеток оказывает определяющее действие на эффективность вакцин на основе мРНК. В общем случае, TRL-7 экспрессировался у людей в плазмацитоидных дендритных клетках (рДК) и В-клетках, а TLR-8 экспрессировался в обычных дендритных клетках (оДК), моноцитах и макрофагах. оДК составляют основную резидентную популяцию ДК в нормальной дерме человека и характеризуются экспрессией  CD1c   (также известной как антиген дендритных клеток крови-1 (BDCA-1)), тогда как плазмацитоидные ДК присутствуют в кожном покрове [129, 151, 152]. Расположение TLR-7 и TLR-8 в различных подпопуляциях ДК и расположение ДК в различных органах может прояснить взаимосвязь между иммунной эффективностью и способом применения, а также составом мРНК-вакцин. Замещение модифицированных нуклеотидов в мРНК уменьшало активацию за счет связывания мРНК с PRR и снижало естественный иммунный ответ [153]. мРНК-вакцины не только стимулировали специфический гуморальный иммунный ответ посредством транслированного антигена, но также и антиген-специфический Т-клеточный ответ. Способ применения и состав вакцины определяют пик экспрессии антигена, и это другой путь моделирования иммунного ответа [94, 154, 155]. Liang и соавт. показали, что кинетики клеточной инфильтрации при в/м и в/к введении в NHP очень близки [156]. В/к-группа продемонстрировала более сильный начальный ответ, вероятно, по причине быстрых нацеливания, активации и транспорта к dLN дендритных клеток кожи. Кроме того, на мышах наблюдалось, что только моноциты кожи и ДК продемонстрировали признаки трансляции антигена на 9-й день, что указывает на прологированную доступность антигена после в/к-доставки и подтверждает более длительную экспрессию кодируемого мРНК антигена [94].
Лучшее понимание последовательности событий, приводящих к трансляции мРНК и активации иммунитета может помочь конструировать мРНК-вакцины, обеспечивающие правильный баланс индукции интерферона типа I, положительно влияющий на результат вакцинирования.

Клинические испытания

По сравнению с профилактическим и терапевтическим применением мРНК при раке, клинические испытания мРНК-вакцин против инфекционных заболеваний все еще находятся на раннем этапе. Пилотные клинические испытания с ДК, трансфицированными мРНК, кодирующей различные антигены ВИЧ-1, клеточные молекулы, или антиген pp65 цитомегаловируса человека показали, что мРНК-вакцины безопасны и могут вызывать антиген-специфичный CD4+ и CD8+ Т-клеточный иммунный ответ, однако, уменьшения вирусной нагрузки не наблюдалось [108].
В недавних клинических испытаниях протамин-связанной мРНК-вакцины против вируса бешенства были получены результаты, показавшие, что РНК, связанная в комплекс с протамином, безопасна и хорошо переносится in vivo, но эффективность сильно зависит от дозы и пути применения. Эффективность применения с помощью безыгольного устройства была намного выше, чем при прямой инъекции [57, 161]. Результаты фазы I показали, что ЛНЧ с модифицированной мРНК-вакциной против H10N8 вызывали сильный гуморальный иммунный ответ у добровольцев при легкой или умеренной нежелательной лекарственной реакции [108].

Перспективы вакцин на основе РНК

Множество публикаций показали, что вакцины на основе мРНК представляют собой многообещающую платформу, которая является гибкой, масштабируемой, недорогой и не нуждающейся в холодовой цепи. Что еще более важно, вакцины на основе мРНК могут удовлетворить потребность в эффективных вакцинах против новых инфекционных заболеваний. В рамках множества доклинических и клинических проектов были достигнуты большие успехи в направлении возможного применения мРНК-вакцин, и было сделано предположение, что профилактика и терапия на основе мРНК может применяться и у человека. Несмотря на то, что при медицинском применении величина ответа была меньше, чем предсказывалось по животным моделям, результаты пилотных клинических испытаний показали хорошую переносимость и то, что мРНК-вакцинация может вызывать антиген-специфичный Т- и В-клеточный иммунный ответ [57, 108]. Поэтому мРНК все также подает большие надежды, но для полноценной разработки мРНК-вакцин необходимо дальнейшее изучение механизма действия и возможностей. Для создания применимых мРНК-вакцин и уменьшения дозы необходим поиск новых стратегий. Как сказано выше, молекулярный механизм естественного иммунного ответа, стимулированного мРНК через PAMP-распознавание, остается неясным. Сделаны большие усилия в направлении улучшения стабильности и эффективности мРНК-вакцины доставки in vivo, включая введение 5'- и 3'-конечных нетранслируемых областей и химически модифицированных нуклеозидов [162-164]. Исследование показало, что удаление примесей дцРНК методом ВЭЖХ-очистки транскрибированной in vitro мРНК продляло трансляцию [35]. Исследование продемонстрировало, что модифицированный нуклеозид уменьшает естественный иммунный ответ и увеличивает экспрессию белка. Оптимизация 5'-нетранслируемой области мРНК, вторичные структуры которой могут распознаваться клеточно-специфичными РНК-связывающими белками или молекулами PAMP, может максимизировать трансляционный выход мРНК при терапии или вакцинации [43, 165]. Однако, неправильное введение модифицированных нуклеозидов может оказывать отрицательное влияние на продукты транскрипции и увеличивать затраты.
Основываясь на результатах вышеописанных исследований, могут быть достигнуты лучшее понимание механизма действия мРНК-вакцин, определение и разработка новых систем доставки и улучшение дизайна мРНК-вакцины [166].
мРНК-вакцины имеют огромный потенциал и предполагают преимущества по сравнению с обычными вакцинами. Растущий массив доклинических и клинических результатов показывает, что профилактика и терапия с использованием мРНК может быть полезной для предотвращения инфекционных заболеваний и для лечения опухолей, а также то, что мРНК-вакцины безопасны и переносимы животными и человеком. Кроме того, будущие усовершенствования должны повысить антиген-специфичный иммунный ответ и величину памяти ответа иммунных клеток, включая память В- и Т-клеточных ответов. Хотя технология мРНК-вакцин не очень широко испытывается на людях, в последнее время появились публикации о доклинических и ранних клинических испытаниях, в которых сообщается о перспективных результатах. Это побудило биокомпании заняться коммерческой разработкой мРНК-вакцин [167, 168]. Несколько частных фондов и организаций поддержали исследование и разработку мРНК-вакцин [169, 170]. Несмотря на необходимость дальнейшей оптимизации процесса производства мРНК-вакцин, эти процессы, мы надеемся, будут упрощены с тем, чтобы начать крупномасштабное производство. Применение мРНК-вакцин у человека и животных — всего лишь вопрос времени.

Финансирование

Priority Academic Talent Team Cultivation Program of Shandong Colleges and Universities, Talent Program of Qingdao Agricultural University. The National Thirteen-Five Key research and development program of China (2017YFD0500805).

Кофликт интересов

Giulietta Maruggi - работник GSK, Rockville, MD, США. Остальные авторы заявляют об отсутствии КИ.

Благодарность

Мы приносим свои извинения за то, что не включили все публикации наших коллег.

Литература