Роль микробиома дыхательных путей в респираторном здоровье

Роль микробиома дыхательных путей в респираторном здоровье

В предлагаемом обзоре обобщены последние достижения в области изучения респираторной микробиоты, взаимосвязи микробиома верхних дыхательных путей и легкого, обсуждения возможных механизмов влияния микробиома на астму и аллергию. Идентификация не только па




The role of the respiratory tract microbiome in respiratory health N. G. Astafieva, D. Yu. Kobzev, I. V. Gamova, I. A. Perfilova, E. N. Udovichenko, L. V. Skuchaeva, I. E. Michailova

The proposed review summarizes recent advances in the study of respiratory microbiota, the relationship between the upper respiratory tract microbiome and the lung, and a discussion of the possible mechanisms of influence of the microbiome on asthma and allergies. Identifying not only pathogenic bacteria, but also commensals in the respiratory tract and gastrointestinal tract (Gut- Lung axis) is an innovative approach to finding out their role in the development of inflammation and modulation of the immune response in respiratory allergies.

Часть 1

История открытия микромира, начавшаяся с изобретения микроскопа голландским натуралистом Антони ван Левенгуком в 1674 г., тесно переплетается с историей макромира, где центральной фигурой является человек и проблемы его здоровья. Эти непростые взаимосвязи рассматривались первоначально как антагонистические в результате доминирования микробной теории развития болезни. Начиная практически с античных времен предполагалось, что болезни человека вызываются «микроскопическими животными», а в последующем эта идея получила развитие, научное обоснование и конкретное подтверждение в концепции микробной теории развития болезней, научный фундамент которой заложили Луи Пастер, Роберт Кох и др. Укоренившийся стереотип необходимости борьбы с микроорганизмами как источником инфекционных заболеваний со времен основоположников микробной теории в последнее время уступил место новому взгляду на проблему взаимоотношения «человек–микроб».

Микробы, появившиеся около 3,5 млрд лет назад, являются самой древней группой организмов из ныне существующих на Земле. Повсеместная распространенность и суммарная мощность метаболического потенциала микроорганизмов определяют их важнейшую роль в круговороте веществ, поддержании динамического равновесия в биосфере Земли. Человек и микробы существуют друг с другом нераздельно, в организме человека обнаруживаются тысячи видов бактерий, архей, грибов и вирусов. Учитывая их огромное влияние на жизнедеятельность макроорганизма, современная наука рассматривает человека уже как суперорганизм, состоящий не только из соматических клеток, но и из огромного количества микроорганизмов. Тысячелетия взаимодействия микрофлоры и организма человека научили человека с помощью иммунной системы не только эффективно защищаться от патогенов, но и предотвращать аутоиммунные и аллергические заболевания — т. е. развили способность к иммунной регуляции или модуляции. Новые взгляды на взаимодействие иммунной системы с нормальной микробиотой как на самостоятельное явление, устанавливающее взаимоотношения с симбионтными микроорганизмами, являются современным подходом к пониманию живых систем, уточнению разнообразных типов многомерных взаимодействий и более полному пониманию сложных фенотипов аллергических и других иммунозависимых заболеваний. Растущая доступность высокопроизводительных технологий позволила провести общесистемное профилирование генома, транскриптома, эпигенома, микробиома и метаболома, изменила наши представления, обеспечивая фундамент для исследования астмы и аллергии на принципиально ином уровне, исходя из новой парадигмы сложного взаимодействия между микробиомом и его хозяином, которые могут провоцировать или препятствовать формированию респираторного заболевания.

Терминология

Термины «микрофлора», «микробиота» и «микробиом» часто используются в литературе как синонимы. Однако существуют некоторые различия между ними. И хотя вопрос об их значении еще обсуждается, следует разграничивать понятия [1].

В связи с имеющимися в публикациях разночтениями по использованию некоторых терминов в контексте данной статьи предлагаются следующие уточнения.

Микрофлора — собирательное название микроорганизмов, находящихся в симбиозе с человеком, включает в себя популяцию видов микроорганизмов, которые живут на коже или внутри человеческого тела — синантропные бактерии, вирусы и грибы, а также другие одноклеточные микроорганизмы, такие как археи и простейшие, для которых организм человека является естественной средой обитания. Поскольку второй корень в данном слове в буквальном переводе звучит как «растительный мир» (дословный перевод слова «флора»), то предлагается использовать как синоним для обозначения микрофлоры более корректный термин «микробиота».

Нормофлора (нормальная микрофлора) — определенное качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов отдельных органов и систем желудочно-кишечного тракта и других слизистых тканей, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие макроорганизма, необходимое для сохранения его нормального состояния.

Микробиом — все гены, находящиеся внутри данной микрофлоры (микробиоты), это совокупность геномов микроорганизмов, занимающих одну экологическую нишу, например, обитателей кожи человека или его кишечника.

Метагеном — весь генетический материал, получаемый из образца, например, содержимого кишечника. Метагеном — это набор генов всех микроорганизмов, находящихся в образце среды.

«Омиксные технологии» (название связано с одинаковым окончанием слов, входящих в сферу эффективных экспериментальных дисциплин — геномика, протеомика, транскриптомика, метаболомика) возникли в результате стремительного развития технологий, позволяющих производить и анализировать большие объемы биологических данных. Современный «омиксный» инструментарий включает высокопроизводительные методы секвенирования ДНК (геномика), определения концентрации и активности белка (протеомика), метаболитов (метаболомика), регуляции экспрессии генов (эпигеномика), а также фармацевтические инструменты для поиска и тестирования новых лекарственных препаратов (фармакоэкономика).

Экспосом — различные воздействия, которые могут повлиять на развитие аллергического заболевания. Эти экспозиции включает в себя следующие три вида воздействий: 1) общая среда, включая городскую или сельскую местность, климат, загрязнение воздуха, образование; 2) конкретная внешняя среда, включая диету, физическую активность, воздействие табака, инфекции, род занятий; 3) внутреннее тело, окружающая среда. Эти факторы одновременно в совокупности с иными взаимодействуют друг с другом и влияют на формирование аллергических заболеваний и респираторной патологии. Экспозиционно-ориентированные проекты (Exposome-focused projects) необходимы для изучения сложного взаимодействия генетики, окружающей среды и микробиома [2].

Научные проекты по изучению микробиома человека

Каждый человек (даже однояйцевые близнецы) имеет уникальную микробную ассоциацию, которая может быть подвержена ежедневным вариациям. Для идентификации и характеристики совокупности микроорганизмов человека был инициирован проект «Микробиом человека» (Human Microbiome Project — HMP). Проект «Микробиом человека» является логическим развитием проекта «Геном человека» (The Human Genome Project, HGP), целью которого была полная расшифровка человеческого генома. При реализации HGP были разработаны и усовершенствованы методы изучения генов человека, которые и легли в основу следующего за ним HMP. К революционизирующим технологиям при изучении геномов можно отнести разработку в 1985 г. полимеразной цепной реакции (ПЦР) — наиболее чувствительного до сих пор метода детектирования ДНК [3].

Официально научная программа «Геном человека» с участием ведущих молекулярно-генетических лабораторий США, Западной Европы, России и Японии оформилась и стартовала в 1990 г., а первый полный геном человека был описан и опубликован в 2003-м, этот проект до сих пор окончательно не завершен, так как нерасшифрованными остаются некоторые участки человеческой ДНК [4].

Начало выполнения проекта «Микробиом человека» — 2008 г., когда Национальные институты здравоохранения США (National Institutes of Health, NIH) поставили цель — описать бактериальную жизнь, связанную с организмом человека, используя технологии проекта «Геном человека».

За сравнительно короткое время (2007–2014 гг.) ученые смогли составить новое представление о многообразии микрофлоры тела человека [5, 6]. Около 200 ученых почти из 80 научно-исследовательских институтов США работали в течение пяти лет над этой первой в истории «переписью» микроорганизмов, которые проживают на всех биотопах (местах обитания) человека. Они расшифровывали ДНК микробов, используя некоторые из тех методов, которые применяются в человеческой генетике. Каталогизация необходимых и достаточных наборов микробиотов, которые поддерживают здоровье, и нормальные диапазоны этих особенностей у здоровых популяций являются важным первым шагом к выявлению и исправлению микробных конфигураций, которые участвуют в болезни [7, 8].

В 2014 г. с целью генерирования ресурсов для характеристики микробиома и выяснения роли микробов в состоянии здоровья и болезненных состояниях стартовала вторая фаза этого крупного международного многопрофильного проекта — Integrative Human Microbiome Project (iHMP) (в настоящее время опубликованы ключевые результаты) [9, 10]. Миссия проекта заключалась в создании интегрированных продольных наборов данных биологических свойств как из микробиома, так и из организма-хозяина с использованием различных «омикс»-технологий.

«Омиксные методы» революционизировали методологию экспериментальной биологии, анализа данных и их интеграции. Усилился акцент на функцию, структуру, эволюцию геномов. Сегодня появилась возможность анализировать первичные структуры геномов, экспрессию генов в них, выявлять различные уровни регуляции и взаимосвязи между ними. Инструментально произошел переход от микрочипов к так называемому высокопроизводительному полногеномному секвенированию, исследуется весь набор ДНК, содержащийся в отдельной клетке, клеточных популяциях или сообществах организмов, и анализируется работа всех генов одновременно. Новые экспериментальные технологии порождают огромные объемы данных (Big Date), анализировать которые можно только методами биоинформатики, в основе которой лежит синтез биологических и математических знаний.

Долгое время при секвенировании геномов микроорганизмов в качестве источников ДНК использовались, как правило, культуры одинаковых клеток. Однако ранние исследования показали, что во многих средах обитания присутствуют большие группы микроорганизмов, которые нельзя вырастить в лабораторной культуре и, следовательно, секвенировать их геномы. Необходимость разработки соответствующих новых (некультуральных) методов исследований микрофлоры [11], в свою очередь, ускорила развитие такого направления в изучении микробов и здоровья человека, как «метагеномика» [12]. Метагеномный анализ позволяет определить видовое разнообразие исследуемого образца без необходимости выделения и культивирования микроорганизмов. Секвенирование и анализ генов из целых сообществ, а не из отдельных геномов показали, что микробы функционируют внутри сообществ, а не как отдельные виды. Этот сдвиг от акцента на отдельных организмах к микробным взаимодействиям был полноценно охарактеризован в докладе Национальной академии наук США (National Academy of Sciences, NAS) в 2007 г., в котором изложены проблемы и перспективы метагеномики как способа понимания основополагающей роли микробных сообществ в целом в окружающей среде, так и в окружающей среде и здоровье человека [13]. Сфера метагеномики огромна. Определение метагеномных характеристик микробных сообществ было представлено в таких проектах, как «Исследование состава биоты желудочно-кишечного тракта человека» (Metagenomics of the Human Intestinal Tract Consortium, MetaHIT) — MetaHIT initiatives, The Inter­national Human Microbiome Consortium [14]. В РФ «Метагеномный анализ биоценоза желудочно-кишечного тракта» выполняется в рамках консорциума «Русский метагеном» [15], в том числе уточняется роль сообщества микроорганизмов дыхательных путей при респираторной патологии [16, 17].

Методы исследований и эволюция представлений о микробиоте и микробиоме

На протяжении многих лет, со времен Пастера и Коха, для изучения микробного разнообразия, селективного выделения представителей основных функциональных групп, в том числе патогенных микроорганизмов, использовались бактериоскопические и бактериологические (культуральные) методы. Используемые с конца XIX в. культуральные анализы (посевы) выявляли не более 1% микрофлоры. Особые проблемы возникали при культивировании анаэробов. В 1985–1993 гг. пришедшие на смену классическим микробиологическим подходам физико-химические методы анализа и молекулярно-генетические методы (ПЦР) позволили определить, что в кишечнике, например, обитает около 1000 видов микроорганизмов, 99% из которых анаэробные. При проведении ПЦР в реальном времени одновременно происходят амплификация, детекция и количественное определение специ­фической последовательности ДНК в образце, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов [18].

Особой вехой в науке и медицине стали работы по секвенированию генома. Новые открытия позволили осознать, что человек — не только продукт своих собственных генов. Для полного понимания генетического материала нужно секвенировать геномы бактерий человека — из кишечника, с кожи, из носового канала, ротовой полости, дыхательных и мочеполовых путей. К началу XXI в. для исследования микробной популяции кишечника применили метод секвенирования генов 16S рРНК. Ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК, стал идеальным маркером для идентификации микроорганизмов. Этот ген есть в геноме всех бактерий и архей, но отсутствует у эукариот и вирусов, имеет как консервативные участки, одинаковые у всех прокариот, так и видоспецифичные. Нуклеотидные последовательности 16S РНК всех известных бактерий общедоступны (генный банк). Секвенирование ДНК (определение нуклеотидной последовательности генов 16S РНК) позволило установить, что в кишечнике живет более тысячи видов микроорганизмов, но только 10% микрофлоры поддается культивированию [19].

С помощью глобального проекта «Микробиом человека» на сегодняшний день расшифровано около 3 млн генов микроорганизмов, что примерно в 150 раз превышает набор генов человека. В силу этого человек приобрел статус «суперорганизма», в котором сосуществует большое количество различных организмов [8, 20].

Соотношение генов организма и микробиома

На рис. 1 показано соотношение генов организма (22 000) и микробиома (8 000 000), от которого зависит степень их возможного влияния на различные функции.

По своей сути этот рисунок иллюстрирует ставший популярным слоган «Вы — это Ваши бактерии» и слова научных популяризаторов: «Мы живем в мире микробов: они его заселили, преобразовали, сделали пригодным для нашей жизни и… превратили нас в среду своего обитания. Можно сколько угодно говорить о взаимоотношениях «хозяин — его микроб», но только кто тут хозяин, вот вопрос» [21].

В любом случае не следует рассматривать микроорганизмы, обитающие в различных локусах организма хозяина, как пассивные участники системы. С функциональной точки зрения их можно оценивать как еще один орган человека. По различным оценкам масса этого органа может достигать нескольких килограммов, а генетическое разнообразие в сотни раз больше генома человека. Изучение функции этого органа в норме и патологии — актуальная задача медицины настоящего и будущего.

Микробиом верхних дыхательных путей и его роль в респираторном здоровье

Наиболее полный анализ микробиоты человека в ходе реализации проекта HMP [5] при рассмотрении 27 отдельных участков тела выявил наличие 22 бактериальных фил, причем большинство последовательностей (92,3%) были связаны только с четырьмя филами:

1) Actinobacteria (36,6%);
2) Firmicutes (34,3%);
3) Proteobacteria (11,9%);
4) Bacteroides (9,5%).

Анализ сайтов распределения бактериальных фил (групп микроорганизмов, объединенных общим родством) у человека по анализу 16S рРНК-секвенирования показал, что самой населенной частью организма является пищеварительный тракт, где обитает 75–78% микроорганизмов — в основном бактерий (Firmicutes, Bacteroides, Actinobacteria и Proteobacteria), в выстилке кишечника обнаруживается от 5000 до 35 000 видов микроорганизмов. Эти факты укладывались в картину традиционных представлений о том, что желудочно-кишечный тракт связан с наиболее высокой бактериальной нагрузкой. Стандартные методы исследования образцов, полученных из локусов с высокой бактериальной нагрузкой, потребовали модификации при изучении сайтов, считавшихся стерильными (легкие), чтобы при обработке ДНК исключать фоновое загрязнение и более четко интерпретировать данные в зависимости от типа образца, объема, анатомического участка и клинических параметров [22].

Изучение физиологической роли микробиоты верхних дыхательных путей (ВДП) представляет особый интерес в свете концепции единства дыхательных путей (United Airways Disease), согласно которой верхние и нижние дыхательные пути считаются единой морфологической и функциональной единицей [23, 24], а связь, существующая между ними, наблюдается в течение многих лет как в отношении здоровья, так и в отношении заболеваний. Анатомические особенности строения дыхательных путей (короткое расстояние от ноздрей до альвеол — 0,5 м, отсутствие каких либо физических барьеров при открытой гортани) обеспечивают быструю микробную иммиграцию в нижние отделы дыхательных путей. Изменения микробных сообществ в ВДП у здоровых индивидов и при патологии позволяют лучше понимать их роль в регуляции иммунного контроля в дыхательных путях.

Связь между носовой микробиотой и реактивным, аллергическим или неаллергическим воспалением как верхних, так и нижних дыхательных путей включает сложную сеть процессов, начиная от рождения до старости. У новорожденных колонизация ВДП происходит в течение первых 2–3 суток. Возрастные особенности расселения микрофлоры представлены в обзорной статье [25].

Сразу же после родов микробиота дыхательных путей новорожденного аналогична материнской. Микробиота новорожденных относительно однородна по всем участкам дыхательных путей, но очень быстро (в течение дней и недель) дифференцируется в сообщества, специ­фичные для верхних и нижних дыхательных путей. Примерно до трех лет микробиота ВДП похожа на кишечную, после чего она приобретает относительную специфичность [26].

Адекватное созревание микробиома кишечника в ранний период может являться мощным протективным фактором в отношении бронхиальной астмы [27]. Ранняя колонизация кишечника Firmicutes, Clostridia и Bacteroides (преобладание у недоношенных) при снижении уровня Lactobacillus и Bifidobacteria, скудное микробное разнообразие предрасполагают к развитию атопии.

Проспективное наблюдение показало, что у детей в возрасте 1 года с незрелой микробной композицией кишечника наблюдается повышенный риск развития астмы в возрасте 5 лет. Эта ассоциация проявляется только у детей, родившихся у астматических матерей, что свидетельствует о том, что отсутствие микробной стимуляции в течение первого года жизни может спровоцировать наследственный риск астмы. Напротив, адекватное созревание микробиома кишечника в этот период может защитить этих детей. Эти находки отчасти поддерживают «гигие­ническую гипотезу» увеличения числа больных с аллергическими заболеваниями. Разнообразие микробиома слизистой оболочки ВДП, вероятно, отражает бесперебойный баланс полезных микроорганизмов и патогенных микроорганизмов, таких как Moraxella catarrhalis, который связан с последующим развитием астмы и пневмонии. Кроме того, такие роды, как Ruminococcus и Bacteroides — специфические ферментеры растительных волокон, участвуют в защите от астмы посредством производства короткоцепочечных жирных кислот, летучих веществ, способных снижать аллергическое воспаление дыхательных путей, опосредованное клетками Т-хелперов типа 2 [28].

В отличие от традиционно проводимых культуральных исследований по ассоциации конкретных бактериальных паттернов с воспалительными профилями заболеваний, методы молекулярной биологии позволили выявлять более разнообразную микробиоту, чем считалось ранее, в том числе в ВДП, и высказать предположение о дополнительном защитном эффекте микробного разнообразия на астму. Первые результаты секвенирования по отношению к дыхательным путям здоровых субъектов привели к следующим фундаментальным выводам: у здоровых людей не только верхние, но и нижние дыхательные пути в норме содержат различные сообщества микроорганизмов. Дыхательные пути пациентов с респираторными заболеваниями содержат различные бактериальные сообщества, которые относительно обогащены типом Proteobacteria [29].

ВДП являются магистральным путем для осаждения бактериальных клеток из воздуха. Идентифицированы доминантные микроорганизмы на слизистых ВДП по ходу воздушного потока, начиная от ноздрей, полости носа, носоглотки [30]. Типичной резидентной флорой в этих локусах являются представители Actinobacteria, Firmicutes и Proteobacteria.

При заболеваниях ВДП, включая аллергический ринит, хронический риносинусит с полипами или без полипов, муковисцидоз, характер микробиоты и воспалительные профили существенно отличаются [31].

Для понимания их роли в патогенезе астмы важную роль сыграли дополнительные исследования носовых таксонов c помощью секвенирования 16S рибосомной РНК. Существуют различия в микробиоме носа у больных с астмой при обострении и стабильном течении. Носовая микробиота у пациентов со стабильной астмой была обогащена таксонами из Bacteroides и Proteobacteria. При обострении астмы более широко представлены четыре вида — Prevotella buccalis, Dialister invisus, Gardnerella vaginalis, Alkanindiges hongkongensis. Такие различия не исключают возможностей использования назальных таксонов как биомаркеров активности астмы [32].

Существует определенная топографическая непрерывность бактериальных популяций в респираторном тракте человека [33], следующим вслед за носом сайтом, детально изученным, стала микробиота носоглотки.

Микробиота носоглотки рассматривается как детерминанта для распространения инфекции на нижние дыхательные пути, тяжести сопровождающих воспалительных симптомов и риска развития будущей астмы. С одной стороны, носоглотка — резервуар для микробов, связанных с острыми респираторными инфекциями (ОРИ). Но пневмонии, возникающие в результате ОРИ в младенчестве, связаны с развитием астмы. Изучение микробиома носоглотки у 234 детей в течение критического первого года жизни показало, что у большинства младенцев первоначально отмечена колонизация Staphylococcus или Corynebacterium, в последующем — стабильная колонизация Alloiococcus или Moraxella. Вирусы инициировали преходящие вторжения Streptococcus, Moraxella или Haemophilus. Ранняя бессимптомная колонизация Streptococcus была сильным предиктором астмы, а использование антибиотиков нарушало бессимптомные образцы колонизации. В отсутствие эффективных антивирусных терапий нацеливание на патогенные бактерии в микробиоме носоглотки может представлять собой профилактический подход к астме [34].

В систематическом обзоре исследований микробиома околоносовых пазух, в которых использовали глубокое секвенирование гена рибосомальной РНК 16S [35], дана информация о выявлении в среднем 1587 таксонов (диапазон 911–2330). Несмотря на гетерогенность исследований, в каждой выборке контрольных пациентов и пациентов с хроническими риносинуситами были идентифицированы филы Firmicutes, Actinobacteria и Bacteroides. Не было обнаружено существенных различий между микробиотой здоровых и микробиотой пациентов с хроническим риносинуситом, но при некоторых фено/эндотипах хронического риносинусита отмечалось обогащение золотистым стафилококком.

Исследование специфического влияния конкретных бактерий на иммунный ответ слизистых носа и околоносовых пазух проливает новый свет на патофизиологию как хронических ринитов, риносинуситов, так и их влияния на астму [31].

Окончание статьи читайте в следующем номере.


Н. Г. Астафьева*, 1, доктор медицинских наук, профессор
Д. Ю. Кобзев**, доктор медицинских наук, профессор
И. В. Гамова*, кандидат медицинских наук
И. А. Перфилова*, кандидат медицинских наук
Е. Н. Удовиченко*, кандидат медицинских наук
Л. В. Скучаева*, кандидат медицинских наук
И. Э. Михайлова*

* ФГБОУ ВО СГМУ им. В. И. Разумовского МЗ РФ, Саратов
** Лидс Тринити университет, Лидс, Великобритания

1 Контактная информация: astang@mail.ru

 

Роль микробиома дыхательных путей в респираторном здоровье (часть 1)/ Н. Г. Астафьева, Д. Ю. Кобзев, И. В. Гамова, И. А. Перфилова, Е. Н. Удовиченко, Л. В. Скучаева, И. Э. Михайлова
Для цитирования:  Лечащий врач № 4/2019; Номера страниц в выпуске: 12-15
Теги: микробиом человека, воспаление, бронхиальная обструкция.

Купить номер с этой статьей в pdf

Все новости и обзоры - в нашем канале на «Яндекс.Дзене». Подписывайтесь

Актуальные проблемы

Специализации




Календарь событий: