Совершенствование алгоритма диагностики демиелинизирующих полиневропатий

Вклинике инфекционных болезней демиелинизирующие заболевания нервной системы являются одной из актуальных проблем, вследствие преобладания тяжелых форм, высоких показателей инвалидизации и летальности 




Вклинике инфекционных болезней демиелинизирующие заболевания нервной системы являются одной из актуальных проблем, вследствие преобладания тяжелых форм, высоких показателей инвалидизации и летальности [1, 2, 3].

В последние годы значительно возрос интерес к поражениям периферической нервной системы, связанным с инфекционной патологией, что обусловлено тенденцией к увеличению частоты этих поражений и изменением характера их течения. Поражения нервной системы, развивающиеся во время или после перенесенных вирусных и бактериальных инфекций, встречаются достаточно часто [1, 4].

Среди приобретенных аутоиммунных демиелинизирующих полиневропатий (ДПНП) выделяют синдром Гийена–Барре (СГБ) и хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию (ХВДП).

Частота встречаемости СГБ, по различным данным, варьирует от 0,4 до 4,0 случаев на 100 тыс. населения ежегодно и в среднем составляет 1,5–2 случая на 100 тыс. населения [5, 6]. В России, как у детей, так и у взрослых, этот показатель составляет 0,6–1,7 на 100 тыс. населения. Заболевание не имеет сезонных колебаний, встречаясь во всех возрастных группах, с тенденцией увеличения заболеваемости с возрастом. Летальность при СГБ, по данным разных авторов, колеблется от 1% до 18%, а среди лиц с тяжелыми формами — от 5% до 33%. ХВДП встречается в любом возрасте, с пиком заболеваемости в возрастной группе 50–60 лет. В год регистрируется 0,15 случая ХВДП на 100 тыс. населения [5, 7].

Синдром Гийена–Барре — одно из наиболее тяжелых заболеваний периферической нервной системы, в 75–90% всех случаев проявляющееся в виде острой воспалительной демиелинизирующей полиневропатии (ОВДП). Гораздо реже (5–15% случаев) встречаются острые моторная (ОМАН) и сенсорно-моторная аксональные невропатии (ОМСАН). Наиболее редкой формой СГБ (3%) является синдром Миллера–Фишера, характеризующийся офтальмоплегией, мозжечковой атаксией и арефлексией при слабовыраженных парезах [5, 7, 8].

Клиническая картина синдрома Гийена–Барре характеризуется нарушением двигательных, чувствительных и вегетативных функций, сухожильной гипо- или арефлексией и болевым синдромом. Черепные нервы при синдроме Гийена–Барре поражаются в 50–90% случаев [5, 7].

В течении классического СГБ выделяют три периода: прогрессирование — нарастание неврологических нарушений в течение 3–4 недель, плато (стабилизация) — длится в среднем 10–14 дней, восстановление — длительность варьирует в широких пределах (от нескольких недель до нескольких месяцев, иногда до 1–2 лет) [5, 7].

При ХВДП, в отличие от СГБ, отмечается более медленное развитие клинической симптоматики (8 недель и более) [9, 10].

Этиология и патогенез синдрома Гийена–Барре до конца не известны. Предполагается, что в основе заболевания лежат аутоиммунные механизмы, где роль пускового фактора отводится микроорганизмам [4, 5, 6, 11]. Основной целью иммунных атак при ОВДП являются шванновские клетки и миелин. В развитии патологических изменений в нервах принимают участие как клеточные, так и гуморальные механизмы. Роль последних особенно велика. При ОВДП под действием тех или иных патогенов происходят активация антиген-специфичных Т- и В-клеток; появление циркулирующих антиганглиозидных или антигликолипидных антител; развитие местных клеточных воспалительных реакций, активация комплемента и отложение мембранолитического атакующего комплекса на миелиновой оболочке периферических нервов в области перехватов Ранвье; начинается и бурно нарастает инвазия миелиновой оболочки нервов сенсибилизированными макрофагами [5, 7].

Также у больных нейропатиями обнаруживаются антитела к различным ганглиозидам. В частности, аутоантитела к ганглиозидам (GM1, GD1а, GD1b и GQ1b), входящим в состав мембран клеток нервной системы и миелиновой оболочки, регистрируются при различных формах СГБ. Показана ассоциация антител к GM1 с острой моторной аксональной нейропатией, анти-GD1b — с сенсорными нейропатиями, а анти-GQ1b — с синдромом Миллера–Фишера [12, 13, 14]. Однако на сегодняшний день патогенетическое участие и диагностическая значимость исследованных антител остаются не доказанными [1, 9].

При ХВДП в сыворотке крови больных выявляются разные классы аутоантител к GM1 (IgG — в 23%, IgA — в 14% и IgM — в 7% случаев). Существенную роль в развитии демиелинизации при ХВДП играют макрофаги, отслаивающие миелин, что приводит к его дегенерации. В очагах воспаления обнаруживают СD4+- и СD8+ лимфоциты. На экспериментальных моделях демиелинизации показано, что Т-клетки накапливаются в периваскулярных пространствах и разрушают гематоневральный барьер. В конечном итоге циркулирующие антитела к миелину и/или компоненты комплемента проникают в эндоневральное пространство, что заканчивается демиелинизацией [7, 10, 13, 14].

Считается, что в основе СГБ лежит патофизиологический механизм, определяющийся в основном нарушениями гуморального иммунитета, тогда как в развитии ХВДП основная роль отводится нарушениям клеточного иммунитета [5, 9, 12].

Несмотря на достижения в понимании отдельных механизмов патогенеза всех ДПНП, которые послужили созданию новых диагностических тестов, данные, приведенные выше, показывают, что «универсального» маркера для каждого из заболеваний, входящих в гетерогенную группу демиелинизирующих, до сих пор не найдено.

Недавно разработанные постгеномные методы анализа и, в частности, протеомные технологии, для выявления в сыворотке крови новых маркеров различных заболеваний, были нацелены в основном на поиск онкомаркеров. В последнее время активно используется метод выделения из плазмы и сыворотки крови репрезентативных наборов пептидов при помощи высокопроизводительных, легко поддающихся автоматизации способов фракционирования на основе различных вариантов хроматографии с последующей регистрацией выделенных пептидов времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрией [15, 16, 17, 18, 19, 20, 21]. В литературе описаны примеры успешного применения этого метода для выявления различий между сывороткой крови пациентов с раком желудка, прямой кишки, простаты, гепатоклеточной карциномы, эндометрия или других видов онкологических заболеваний и сывороткой крови здоровых людей [22, 23, 24, 25].

При этом исследования, направленные на выявление маркеров демиелинизирующих заболеваний нервной системы, единичны и проводятся преимущественно зарубежными исследователями.

Таким образом, представленный анализ данных литературы показал, что выбранная проблема является чрезвычайно актуальной, прежде всего, по своим отдаленным, но довольно тяжелым неврологическим последствиям, развитие которых связано с несвоевременным распознаванием описанной патологии. В связи с этим создание диагностического алгоритма и критериев прогнозирования демиелинизирующих заболеваний нервной системы, разработка простого и доступного широкой медицинской практике метода диагностики этой патологии способствовали бы своевременному распознаванию и, следовательно, эффективной терапии подобных нежелательных последствий инфекционных процессов различной этиологии.

Материал и методы исследования

Согласно разработанному протоколу комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов с демиелинизирующими полиневропатиями, включающему помимо общепринятых методов исследования развернутое иммунологическое и протеомное исследование крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), нами были сформированы две группы: основная и контрольная.

Основную группу составили 60 больных демиелинизирующими заболеваниями периферической нервной системы от 16 до 80 лет без ограничения по полу и тяжести болезни. В составе группы были выделены две подгруппы: 36 больных острой воспалительной демиелинизирующей полиневропатией (синдром Гийена–Барре) и 24 — хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатией.

Диагноз СГБ устанавливался на основании характерной клинической картины: остро развившийся вялый, относительно симметричный, пара- или тетрапарез, сопровождающийся снижением или выпадением глубоких рефлексов. У подавляющего большинства больных наблюдались нарушения поверхностной и глубокой чувствительности. У трети больных отмечались признаки поражения черепно-мозговых нервов и вегетативные нарушения. Прогрессирование болезни длилось не более четырех недель, и восстановление начиналось через 2–4 недели после достижения фазы плато.

Диагноз ХВДП устанавливался при нарастании мышечной слабости в конечностях, длящейся более 8 недель, с эпизодами нарастания и снижения мышечной силы, или при монотонно прогрессирующей мышечной слабости без эпизодов улучшения. Подтверждением диагноза, наряду с характерной клинической симптоматикой, также служили типичные изменения, выявленные при электронейромиографии (ЭНМГ), отсутствие патологических изменений на МРТ головного и спинного мозга и белково-клеточная диссоциация в цереброспинальной жидкости.

Распределение пациентов по полу было относительно равномерным, в то время как возрастной пик пришелся на группу 26–45 лет в обеих подгруппах. Относительная однородность групп позволила оперировать средними значениями показателей в ходе дальнейших исследований без учета сочетания этих ведущих демографических признаков.

В контрольную группу вошли 36 клинически здоровых человек от 18 до 65 лет из числа практически здоровых доноров. У обследованных не выявлено сопутствующих хронических заболеваний нервной системы и на момент обследования не определялись какие-либо субъективные и объективные признаки острых заболеваний; в анамнезе не отмечено аллергических реакций и аутоиммунных состояний, а также алкоголизма и наркомании.

Для фракционирования образцов сывороток крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) использовали наборы для профилирования, содержащие магнитные микрочастицы с обращенно-фазовой (MB-HIC 8, MB-HIC 18), слабой катионообменной (MB-WCX) и металлоаффинной (MB-IMAC Cu) поверхностями производства компании Bruker Daltonics (Германия). Фракционирование сывороток крови проводили на специализированном роботе ClinProt robot (Bruker Daltonics, Германия). Масс-спектры получали с использованием времяпролетного МАЛДИ масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия). Десорбцию образцов осуществляли иррадиацией азотным лазером (длина волны 337 нм), работающим при частоте 25 Гц. Для удаления пиков матрицы использовали максимальный уровень подавления сигнала вплоть до 900 Да. Автоматическую регистрацию масс-спектров проводили в линейном режиме положительно заряженных ионов в диапазоне масс 1–15 кДа. Для калибровки использовали калибровочную смесь, содержащую пептиды и белки в диапазоне масс 1–17 кДа. Для увеличения чувствительности масс-спектрометрической детекции белков и пептидов избыток матрицы удаляли 10 импульсами лазера при мощности 45% с последующей аккумуляцией данных при мощности лазера 27%. Для каждого спектра суммировали результаты 720 лазерных импульсов (по 60 импульсов с 12 различных точек пятна). Суммировали спектры с отношением сигнал/шум > 5 и разрешением > 300.

Иммунологическое исследование крови проводилось методом проточной цитофлуориметрии с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCanto II после автоматизированной пробоподготовки цельной крови в соответствии с инструкциями по применению прибора и моноклональных антител. В качестве моноклональных антител был использован набор BD Multitest 6-Color TBNK Reagent, содержащий в своем составе anti-CD3 (FITC), anti-CD16/CD56 (PE), anti-CD45 (PerCP-Cy5.5), anti-CD4 (PE-Cy7), anti-CD19 (APC), anti-CD8 (APC-Cy7). В сыворотке крови методом иммуноферментного анализа проводилось определение уровней IgM, IgG, IgA, IgE, а также антител к ганглиозидам (асиало-GM1, GM1, GM2, GD1a, GD1b, GQ1b). Для определения вышеуказанных антител к ганглиозидам использовали набор BUHLMANN GanglioCombi EIA.

Результаты и их обсуждение

В результате сравнения масс-спектрометрических профилей образцов сыворотки крови, предварительно фракционированных на магнитных микрочастицах различного типа, мы остановили свой выбор на микрочастицах со слабой катионообменной поверхностью MB-WCX как обеспечивающих регистрацию наибольшего количества, по сравнению с другими типами частиц, масс-спектрометрических пиков (рис. 1).

На группе контрольных образцов (n = 36) отработан стандартный протокол получения образцов сыворотки крови и ЦСЖ человека для последующего фракционирования белковой фракции данных образцов на магнитных микрочастицах со слабой катионообменной поверхностью. Согласно разработанному лабораторному протоколу сформирован банк образцов сыворотки крови и ЦСЖ больных демиелинизирующими полиневропатиями, практически здоровых доноров и интактной ЦСЖ. Дальнейшие пилотные исследования позволили накопить воспроизводимые масс-спектры вышеуказанных образцов.

При анализе полученных данных выявлены статистически значимые различия масс-спектров, полученных от сывороток крови пациентов с демиелинизирующими полиневропатиями, и масс-спектров, полученных от практически здоровых доноров, что проявилось в высоких значениях специфичности (98,6%; кросс-валидация — 99,35%) и чувствительности (100%; кросс-валидация — 99,26%) построенной на этом массиве данных классификационной модели (рис. 2).

При масс-спектрометрическом профилировании ЦСЖ количество детектируемых в образцах пиков значительно уступало количеству пиков, наблюдаемых в масс-спектрах образцов сыворотки крови. Предварительные исследования образцов ЦСЖ, полученных от больных демиелинизирующими полиневропатиями и практически здоровых людей, достоверных отличий в масс-спектрометрических профилях образцов ЦСЖ этих групп не выявили (рис. 3).

Изучение иммунограмм и серологических данных у больных СГБ проводилось в сравнительном аспекте при сопоставлении с показателями здоровых людей и больных ХВДП, а также в динамике периода нарастания симптоматики (первые четыре недели болезни), путем анализа результатов исследования при острой воспалительной демиелинизирующей полиневропатии и аксональных формах СГБ.

Результаты статистического анализа иммунологических данных в основной группе и группах сравнения показали, что, несмотря на значительные отличия от контроля, иммунограммы больных СГБ и ХВДП на уровне средних значений достоверно не отличаются друг от друга, хотя тенденции по более значительному отклонению числа активированных (CD3+/HLA-DR+) клеток и содержанию IgE в крови имеются. Существенные различия (р < 0,05) в группах больных СГБ и ХВДП были обнаружены только на уровне антител к ганглиозидам GM2, GD1a, GD1b, что может иметь дифференциально-диагностическое значение.

Различия между параметрами иммунного статуса у пациентов с разными формами СГБ (ОВДП и ОАН) были минимальными и касались только выраженности процессов активации Т-лимфоцитов, которая проявлялась более высоким числом клеток, экспрессирующих маркеры поздней активации (CD3+/HLA-DR+). Однако попытка статистически установить наиболее информативные иммунологические критерии различия основных форм СГБ при помощи дискриминантного анализа показала, что достоверной информативностью обладают, помимо CD3+/HLA-DR+ клеток, еще такие показатели, как абсолютное число Т-лимфоцитов (CD3+), в частности, Т-хелперов (CD4+), а также уровни IgM и IgA. Все отмеченные сдвиги не только позволяют высказать предположения о преобладании тех или иных механизмов развития СГБ на разных этапах заболевания, но и использовать информативные иммунологические критерии как дифференциально-диагностические признаки.

Выводы

Впервые в алгоритм исследования больных с демиелинизирующими полиневропатиями (СГБ и ХВДП) включен масс-спектрометрический анализ сыворотки крови и ЦСЖ в сочетании с комплексной оценкой иммунологических показателей (в том числе определение антител к ганглиозидам).

Метод фракционирования белков сыворотки крови и ЦСЖ с использованием магнитных микрочастиц со слабой катионообменной поверхностью (MB-WCX) позволил создать две сопоставимые модели, имеющие диагностическую значимость при обследовании больных с демиелинизирующими полиневропатиями. В результате проведенных контрольных лабораторных исследований созданы уникальные сопоставимые выборки масс-спектометрических профилей сыворотки крови и ЦСЖ больных ДПНП, а также сыворотки крови здоровых доноров и интактной ЦСЖ.

Дополнительными иммунологическими критериями разграничения острой воспалительной демиелинизирующей полинейропатии и острых аксональных нейропатий может служить количественное содержание CD3+ клеток в крови на второй неделе развития синдрома Гийена–Барре, CD3+/HLA-DR+ клеток на первой неделе болезни и у большей части больных — уровень IgM на второй неделе заболевания.

Можно предположить, что предлагаемый подход позволит корректно интерпретировать не только результаты протеомных и иммунологических исследований сывороток крови больных, уже страдающих демиелинизирующими полиневропатиями, но и пациентов, у которых патология еще не развилась, но есть генетически детерминированная предрасположенность к ее развитию.

Работа выполняется при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям.

Литература

  1. Пирадов М. А., Супонева Н. А. Синдром Гийена–Барре: современное состояние проблемы // Российский медицинский форум 2007. Сб. тезисов. М., 2007 С. 1–11.
  2. Fletcher D. D., Lawn N. D., Wolter T. D. Long-term outcome in patients with Guillain–Barre syndrome requiring mechanical ventilation // Neurology. 2000. Vol. 54. P. 2311.
  3. Lawn N. D., Fletcher D. D., Henderson R. D. et al. Anticipating mechanical ventilation in Guillain–Barre syndrome // Arch. Neurol. 2001. Vol. 58. P. 893.
  4. Hadden R. D., Karch H., Hartung H. P. et al. Preceding infection, immune factors, and outcome in Guillain-Barre syndrome // Neurology. 2001. Vol. 56. P. 758–765.
  5. Пирадов М. А. Синдром Гийена–Барре. М.: Интермедика, 2003. 240 с.
  6. Скрипченко Н. В., Команцев В. Н. Инфекционные заболевания периферической нервной системы у детей. М.: Медицина, 2006. 560 с.
  7. Левин О. С. Полиневропатии. М.: Медицинское информационное агентство, 2006. 491 с.
  8. Asbury A. K. New concepts of Guillain–Barre syndrome // J. Child. Neurol. 2000. Vol. 15. P. 183–191.
  9. Строков И. А., Ахмеджанова Л. Т. Хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия: современное состояние проблемы диагностики и лечения // Неврологический журнал. 2008. № 6. С. 4–12.
  10. Бамбеева Р. Ц., Дунаевская Г. Н., Нанкина И. В. Идиопатические воспалительные полиневропатии у детей // Лечащий Врач. 2008. № 7. С. 52–57.
  11. Студеникин В. М., Шелковский В. И. Современные представления о синдроме Гийена-Барре в детской неврологии // Лечащий Врач. 2009. № 6.
    С. 30–33.
  12. Oshima Y., Mitsui T., Yoshino H. et al. Central motor conduction in patients with anti-ganglioside antibody associated neuropathy syndrome and hyperreflexia // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2002. Vol. 73. Р. 568–573.
  13. Hartung H. P., Pollard J. D., Harvey G. K., Toyka K. V. Immunopathogenesis and treatment of the Guillain-Barre syndrome. Part I // Muscle Nerve. 1995. Vol. 18. P. 137–153.
  14. Hartung H. P., Pollard J. D., Harvey G. K., Toyka K. V. Immunopathogenesis and treatment of the Guillain-Barre syndrome. Part II // Muscle Nerve. 1995. Vol. 18. P. 154–164.
  15. De Noo M. E., Deelder A. M., van der Werff M. et al. MALDI-TOF serum protein profiling for the detection of breast cancer // Onkologie. 2006. Vol. 29. Р. 501–506.
  16. Ebert M. P., Niemeyer D., Deininger S. O. et al. Identification of increased fibrinopeptide A serum protein levels in gastric cancer sera by magnet bead assisted MALDI-TOF mass spectrometry // J. Proteome Res. 2006. Vol. 5 (9). Р. 2152–2158.
  17. Shin S., Cazares L. H., Schneider H. et al. Serum Biomarkers to Differentiate Benign and Malignant Mammographic (BIRADS 4) Lesions // J. Am. Coll. Surg. 2007. Vol. 204 Р. 1065–1071.
  18. Villanueva J., Philip J., Entenberg D. et al. Serum peptide profiling by magnetic particle-assisted, automated sample processing and MALDI-TOF mass spectrometry // Anal. Chem. 2004.
    Vol. 76. Р. 1560–1570.
  19. Villanueva J., Philip J., Chaparro C. A. et al. Correcting common errors in identifying cancer-specific serum peptide signatures // J. Proteome Res. 2005. Vol. 4. Р. 1060–1072.
  20. Lopez M. F., Mikulskis A, Kuzdzal S. et al. A novel, high-throughput workflow for discovery and identification of serum carrier protein-bound peptide biomarker candidates in ovarian cancer samples // Clin. Chem. 2007. Vol. 53 (6). Р. 1067–1074.
  21. Whiteaker J. R., Zhang H., Eng J. K. et al. Head-to-head comparison of serum fractionation techniques. Journal of Proteome Research // J. Proteome Res. 2007. Vol. 6 (2). Р. 828–836.
  22. Li J., Zhang Z., Rosenzweig J. et al. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer // Clin. Chem. 2002. Vol. 48. Р. 1296–1304.
  23. Zhou L., Cheng L., Tao L. et al. Detection of hypopharyngeal squamous cell carcinoma using serum proteomics // Acta Otolaryngol. 2006. Vol. 126. Р. 853–860.
  24. Zheng G. X., Wang C. X., Qu X. et al. Establishment of serum protein pattern for screening colorectal cancer using SELDI-TOF-MS // Exp. Oncol. 2006. Vol. 28 (4). Р. 282–287.
  25. Zhang H., Kong B., Qu X. et al. Biomarker discovery for ovarian cancer using SELDI-TOF-MS // Gynecol Oncol. 2006. Vol. 102. Р. 61–66.

Н. Д. Ющук*, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН
О. Л. Тимченко*, кандидат медицинских наук
Е. А. Морозова*
И. П. Балмасова*, доктор медицинских наук, профессор
М. М. Гультяев*, кандидат медицинских наук
В. М. Говорун**, доктор биологических наук, профессор
Р. Х. Зиганшин***, кандидат химических наук
Л. Н. Икрянникова**, кандидат химических наук
Е. Н. Ильина**, кандидат биологических наук, доцент
Е. А. Климова*, доктор медицинских наук, профессор
С. В. Манжеева*
М. А. Пирадов****, доктор медицинских наук, профессор
Н. А. Супонева****, кандидат медицинских наук
Ю. А. Федькина*

* ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава, Москва
** ФГУ НИИ ФХМ ФМБА России, Москва
*** ИБХ им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва
**** НЦН РАМН, Москва

Ключевые слова: синдром Гийена–Барре, хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, острая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, острая моторная аксональная невропатия, острая моторно-сенсорная аксональная невропатия, аутоантитела к ганглиозидам, постгеномные методы, протеомные исследования, фракционирование, магнитные микрочастицы, катионообменная поверхность, времяпролетная МАЛДИ масс-спектрометрия, масс-спектрометрический анализ, иммунологическое исследование, пилотные исследования.


Рис. 1. Усредненные масс-спектры образцов сыворотки крови, полученных от практически здоровых доноров. Фракционирование образцов проводилось на магнитных микрочастицах MB-HIC 8 (А), MB-WCX (Б) и MB-IMAC Cu (В) с использованием модифицированного протокола

Рис. 2. Масс-спектрометрические профили образцов сыворотки крови, полученных от практически здоровых доноров (А) и больных синдромом Гийена–Барре (Б). Фракционирование образцов проводилось на магнитных микрочастицах MB-WCX с использованием модифицированного протокола. По оси ординат отложены номера спектров, по оси абсцисс — отношение массы к заряду в Да. Интенсивность окрашивания полос соответствует интенсивности пика в спектре. Данные приведены в виде псевдогеля

Рис. 3. Масс-спектрометрические профили образцов интактной спинномозговой жидкости (А) и больных синдромом Гийена–Барре (Б). Фракционирование образцов проводилось на магнитных микрочастицах MB-WCX. По оси ординат отложены номера спектров, по оси абсцисс — отношение массы к заряду в Да. Интенсивность окрашивания полос соответствует интенсивности пика в спектре. Данные приведены в виде псевдогеля

Купить номер с этой статьей в pdf

Все новости и обзоры - в нашем канале на «Яндекс.Дзене». Подписывайтесь

Актуальные проблемы

Специализации




Календарь событий: