Эбастин обладает не только антигистаминным эффектом

Эбастин имеет способность ингибировать высвобождение лейкотриена C4/D4 (LTC4/D4), простагландина D2 (PgD2) и цитокинов из клеток полипа носа in vitro. Каребастин угнетает высвобождение простагландина D2 (PgD2), но в целом имеет меньшее, чем эбастин, влиян




Ebastine has not only antihistamine effect

Ebastin is able to inhibit release of leukotrein C4/D4 (LTC4/D4), prostaglandin D2 (PgD2) and cytokines from nasal polypus cells in vitro. Carebastine suppresses release of prostaglandin D2 (PgD2), but in general has less influence on this and other mediators than ebastine.

РЕКЛАМА

Антагонисты Н1-гистаминового рецептора, также как и стероиды для местного применения, остаются препаратами выбора при аллергическом рините. Не считая сильного антигистаминного эффекта, механизм действия антагонистов H1-гистаминового рецептора требует дальнейшего изучения, поскольку эти препараты обладают свойствами, которые не связаны с блокировкой гистамина на уровне его рецептора [1].

Для оценки противоаллергических свойств антагонистов Н1-гистаминового рецептора могут быть использованы тесты как in vitro, так и in vivo. Клетки, изолированные из носовых полипов, представляют интересную модель для изучения фармакологии противоаллергических и противоастматических лекарственных препаратов, поскольку они происходят из воспаленной ткани и являются сенсибилизированными, подобно клеткам при воспалении, обусловленном ринитом [2–5].

Носовые полипы, которые могут быть различной этиологии, характеризируются наличием гиперплазированной отекшей слизистой оболочки и произрастают из этмоидальных пазух [6]. Из клеток носового полипа высвобождаются многочисленные разнообразные медиаторы, принимающие участие в аллергической реакции, среди которых эйкозаноиды, гистамин и цитокины. После пассивной сенсибилизации клетки носового полипа могут быть активированы зависимым от антител к иммуноглобулину Е механизмом высвобождения многих из этих медиаторов.

Мы провели исследование с использованием изолированных клеток, полученных из удаленных хирургическим путем носовых полипов, с целью изучения влияния эбастина и каребастина in vitro на высвобождение эйкозаноидов (лейкотриенов C4/D4 (LTC4/D4) и простагландина D2 (PGD2)) после стимуляции антителами к иммуноглобулину Е и спонтанное высвобождение цитокинов (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) и интерлейкина-8 (ИЛ-8)).

Назальная провокационная проба с аллергенами широко применялась для изучения противоаллергической активности антагонистов H1-гистаминового рецептора in vivo. Лаваж слизистой носа после воздействия аллергенов дает возможность получить и измерить концентрацию воспалительных медиаторов и цитокинов [1, 7, 8], высвобождение которых может быть блокировано антагонистами H1-гистаминового рецептора. С целью измерения влияния эбастина на высвобождение медиаторов аллергии in vivo, мы сравнивали действие эбастина в дозировке 10 мг и 20 мг один раз в сутки на высвобождение медиаторов воспаления, с действием плацебо, в двойном слепом перекрестном исследовании с участием 12 пациентов с сезонным аллергическим ринитом.

Материалы и методы исследования

Исследование носового полипа in vitro

Клетки носового полипа были получены от 10 пациентов (6 мужчин, 4 женщины в возрасте от 18 до 61 года) с полипозом носа. Клетки были изолированы согласно методике, раннее применявшейся для получения клеток паренхимы легких, поскольку было обнаружено, что клетки, полученные путем ферментации, могут быть использованы для фармакологических исследований [9].

Полип сперва рассекался ножницами на кусочки размером приблизительно 1 мм3, а разъединение клеток проводилось путем ферментативного расщепления модифицированным методом Holgate и соавт. [10, 11]. Рассеченная ткань полипа в течение 2 ч находилась в четырех объемах среды для культивирования RPMI (среда Института имени Розуэелла Парка) линии 1640 (фирма «Гибко» (Gibco), Пейсли, Шотландия), которая содержит гиалуронидазу в концентрации 0,75 г/л, коллагеназу в концентрации 1,5 г/л и протеазу типа XIV в концентрации 2 г/л (все получено из компании «Сигма» (Sigma Co.), Сент-Луис, Миссури). Изоляция клеток проводилась при 37 °C в качающейся водяной бане. В конце периода ферментативного расщепления клетки последовательно отфильтровывались, с целью отделения от нерасщепленной ткани. Затем они повторно растворялись в среде RPMI и троекратно отмывались для удаления ферментов. Клетки были сенсибилизированы путем инкубации с 10% атопической сывороткой при 37 °C в течение 1 ч, а затем снова трижды отмыты.

Жизнеспособность клеток оценивалась до стимуляции и в конце периода инкубации путем измерения вытеснения красителя трипанового синего. Клетки описывались на стеклах, приготовленных путем центрифугирования и окрашиванных по Маю–Грюнвальду–Гимзе (May–Grunwald–Giemsa).

С целью измерения влияния эбастина и его метаболита каребастина на высвобождение медиаторов воспаления, подготовленные клетки носового полипа были повторно растворены в среде RPMI с концентрацией 1 × 106 клеток/мл и в течение 20 минут преинкубированы с эбастином или каребастином (в концентрации 0,1, 1, и 10 мкмоль/л) или с растворителем, который использовался для растворения веществ (диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 0,1%). Затем, с целью измерения эйкозаноидов, они подвергались воздействию специфических ε-цепей антител к иммуноглобулину Е (компания «Иммунотех» (Immunotech), Люмини, Франция) в концентрации 10 мг/л в течение 45 минут при 37 °C. Для измерения цитокинов клетки инкубировались в течение 24 ч без каких-либо стимуляторов секреции.

Для измерения высвобождения медиаторов лейкотриенов C4/D4 (LTC4/D4) и простагландина D2 (PGD2) использовался имеющийся в продаже набор для иммуноферментного анализа (ИФА) (компания «Сталлержен» (Stallergenes), Френ, Франция), а цитокины (ГМ-КСФ, ФНО-альфа и ИЛ-8) измерялись твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) (компания «Гензим» (Genzyme), Кембридж, Массачусетс, США).

Исследование активности эбастина in vivo

Исследование носовой провокационной пробы было проведено с участием 12 пациентов в возрасте от 20 до 38 лет после получения их информированного согласия. Исследование было разрешено Этическим комитетом университета Монпелье (Montpellier University), Франция. У пациентов наблюдались симптомы сезонного аллергического ринита и положительные кожные пробы с 1/100 (вес/объем) стандартизированного экстракта пыльцы ежи сборной (Dactylis glomerata) (компания «Лаборатории Сталлержес» (Laboratories des Stallergenes), Френ, Франция). У всех пациентов наблюдалось повышение титров иммуноглобулина Е к пыльце ежи сборной в плазме крови (радиоаллергосорбентный тест «Фадебаст» (Phadebast RAST); компания «Фармация Диагностикс» (Pharmacia Diagnostics), Упсала, Швеция). Никто из пациентов не получал лечения антигистаминными препаратами, кортикостероидами или кетотифеном в течение 2 недель до начала исследования, а также астемизолом или имипрамином в течение предыдущего месяца.

Назальная провокационная проба проводилась в то время, когда никакой специфической пыльцы в атмосфере не обнаруживалось. Капсулы, содержащие лактозу или зерна пыльцы ежи сборной в количестве, увеличивающемся от 50 до 156 250 зерен (5,5-кратное увеличение) (компания «Лаборатории Сталлержен» (Laboratoires des Stallergenes), Френ, Франция), инсуфлировались в ноздри носовым аэрозолем Spinhaler (компания «Лаборатории Фисонс» (Fisons Laboratories), Лафборо, Англия); пациенты задерживали дыхание при инсуфляции. Для каждого количества пыльцы носовой аэрозоль Spinhaler применяли 5 раз. Каждая капсула раскрывалась после инсуфляции, с целью убедиться, что она полностью пуста.

Сначала инсуфлировалась лактоза, и последующие симптомы регистрировались в течение 15 минут. Затем каждые 15 минут в ноздри инсуфлировались зерна пыльцы в порядке увеличения количества до тех пор, пока по шкале симптомов не получали 5 баллов: 5 последовательных чиханий (3 балла), ринорея (от 1 до 3 баллов), заложенность носа (от 1 до 3 баллов) или зуд в носу (1 балл). Назальная провокационная проба проводилась путем инсуфляции зерен пыльцы ежи сборной в количестве, увеличивающемся от 50 до 781 250 до тех пор, пока суммарный балл по шкале симптомов не достигнет исходного уровня [12].

Выделения из носа получали путем назального лаважа до реакции и в течение ранней и поздней фаз реакции. До каждой провокационной пробы проводился лаваж каждой ноздри 5 мл физиологического раствора троекратно с целью уменьшения уровня медиаторов. Назальный лаваж также проводился через 15 минут после вдувания лактозы или аллергена и повторялся через 6 часов после немедленной реакции (поздняя фаза реакции).

Выделения из носа хранились на льду до конца эксперимента. Затем они центрифугировались при +4 °C в течение 15 минут при 15 000 g. Твердая фаза отделялась от гелеобразной фазы пипеткой и хранилась при –20 °C до момента проведения анализа.

Для измерения высвобождения медиаторов лейкотриенов C4/D4 (LTC4/D4) и простагландина D2 (PGD2) использовался имеющийся в продаже набор для иммуноферментного анализа (EIA) (компания «Сталлержен» (Stallergenes), Френ, Франция), а цитокины (ГМ-КСФ, ФНО-альфа и ИЛ-8) измерялись твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) (компания «Гензим» (Genzyme), Кембридж, Массачусетс, США).

Первая назальная провокационная проба проводилась до какого-либо лечения для определения исходной реактивности пациентов по отношению к аллергенам. С целью измерения влияния эбастина на аллергическую реакцию, пациенты получали лечение плацебо или эбастин в дозировке 10 мг или 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней, согласно плану перекрестного исследования. Интервал между последним приемом лекарственного препарата и аллергической пробой составлял 1 час. Назальные провокационные пробы проводились в конце каждого периода лечения с 7-дневным периодом «отмывки» между периодами лечения.

Результаты

Исследование носового полипа in vitro

Популяция клеток, полученных из носовых полипов, включала эпителиальные клетки, мононуклеарные клетки, эозинофилы и нейтрофилы. Однако наблюдалась высокая степень гетерогенности полипов по клеточному составу. Ни эбастин, ни каребастин не оказывали никакого влияния на жизнеспособность клеток, определенную по захвату красителя трипанового синего.

Антитела к иммуноглобулину Е вызывали значительное усиление высвобождения LTC4/D4 и PgD2 из клеток носового полипа in vitro: спонтанное высвобождение (среднее ± стандартное отклонение (SD)) по сравнению с индуцированным антителами к иммуноглобулину Е высвобождением было 0,11 ± 0,11 против 1,46 ± 2,2 нг/106 клеток для PgD2 и 0,13 ± 0,04 против 2,16 ± 0,92 нг/106 клеток для LTC4/D4.

Эбастин в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкмоль/л значительно ингибировал это высвобождение PgD2 и LTC4/D с дозозависимым эффектом (табл.). Концентрации эбастина, необходимые для ингибирования высвобождения этих двух медиаторов на 30% (IC30), были рассчитаны как 2,57 и 9,6 мкмоль/л соответственно. Каребастин также проявил способность ингибировать высвобождение PgD2 из клеток носового полипа, но был менее активным, чем эбастин: значение 30% ингибирующей концентрации (IC30) — 8,14 мкмоль/л. Эбастин и каребастин также ингибировали высвобождение цитокинов, хотя каребастин оказывал, в целом, меньшее влияние на эти медиаторы (табл.).

Влияние эбастина и каребастина на высвобождение медиаторов из изолированных человеческих клеток носового полипа

Исследование активности эбастина in vivo

Среднее количество зерен пыльцы, необходимое для индукции аллергической реакции, было достоверно ниже у принимавших плацебо, по сравнению с теми, кто принимал эбастин в дозировке 10 и 20 мг (рис. 1). Эбастин в дозировке 20 мг вызывал достоверное повышение среднего порогового количества зерен пыльцы, необходимого для индукции положительного ответа, по сравнению с плацебо (р < 0,003) и эбастином в дозировке 10 мг (р < 0,02).

Эбастин уменьшал высвобождение ГМ-КСФ с дозозависимым эффектом (рис. 2). Высвобождение лейкотриена LTC4/D4 и PgD2, обнаруженное у большинства пациентов при назальной провокационной пробе, достоверно не нарушалось под влиянием эбастина. Кроме того, эбастин не влиял на высвобождение цитокинов.

Клинически поздняя фаза реакции (заложенность носа, в итоге сопровождавшаяся ринореей) наблюдалась у крайне небольшого количества пациентов, недостаточного для исследования.

Среднее пороговое количество зерен пыльцы

Высвобождение ГМ-КСФ через 6 ч после назальной провокационной пробы с аллергеном

Обсуждение

Как было уже показано ранее с применением назальной провокационной пробы с аллергеном, азатидин, лоратидин и терфенадин ингибируют высвобождение гистамина, PgD2 и кининов [1, 13–15]. Кроме того, азеластин и цетиризин ингибируют высвобождение лейкотриенов [15, 16]. Мы показали, что эбастин блокирует высвобождение индуцированных антителами к иммуноглобулину Е простагландина D2 (PgD2) и лейкотриенов C4/D4 (LTC4/D4) из человеческих клеток носового полипа in vitro и ингибирует высвобождение цитокинов. Ни в каких других исследованиях не применялась данная модель с целью исследования влияния других антигистаминных препаратов на высвобождение медиаторов in vitro; таким образом, не представляется возможным сравнить эти препараты с эбастином. Механизмы, с помощью которых антигистаминные препараты нарушают высвобождение медиатора, остаются неописанными.

Заключение

Таким образом, эбастин, антагонист H1-гистаминового рецептора, имеет способность ингибировать высвобождение лейкотриена C4/D4 (LTC4/D4), простагландина D2 (PgD2) и цитокинов из клеток полипа носа in vitro. Каребастин угнетает высвобождение простагландина D2 (PgD2), но в целом имеет меньшее, чем эбастин, влияние на этот и другие медиаторы. У пациентов с сезонным аллергическим ринитом эбастин в дозировке 10 и 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней достоверно повышал количество зерен пыльцы, необходимых для индукции аллергического ответа, по сравнению с плацебо, а также уменьшал высвобождение ГМ-КСФ.

Литература

  1. Bousquet J., Lebel B., Chanal I. et al. Antiallergic activity of H1-receptor antagonists assessed by nasal challenge // J. Allergy Clin. Immunol. 1988; 82: 881–887.
  2. Stoop A. E., van der Heijden H. A., Biewenga J. et al. Eosiniphils in nasal polyps and nasal mucosa: an immunohistochemical study // J. Allergy Clin. Immunol. 1993; 91: 616–622.
  3. Linder A., Karlsson-Parra A., Hirvela C. et al. Immunocompetent cells in human nasal polyps and normal mucosa // Rhinology. 1993; 31: 125–129.
  4. Ohno I., Lea R. G., Flanders K. C. et al. Eosinophils in chronically inflamed human upper airway tissues express transforming growth factor beta 1 gene (TGF beta 1) // J. Clin. Invest. 1992; 89: 1662–1668.
  5. Hamilos D. L., Leung D. Y., Wood R. et al. Chronic hyperplastic sinusitis: association of tissue eosinophilia with mRNA expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3 // J. Allergy Clin. Immunol. 1993; 92: 39–48.
  6. Tos M., Sasaki Y., Ohnishi M. et al. Fireside conference 2. Pathogenesis of nasal polyps // Rhinology. 1992; 14 Suppl. 181–185.
  7. Naclerio R. M., Meier H. L., Kagey-Sobotka A. et al. In vivo model for the evaluation of topical antiallergic medications // Arch. Otolaryngol. 1984; 110: 25–27.
  8. Sim T. C., Grant J. A., Hilmeister K. A. et al. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994; 149: 339–344.
  9. Campbell A. M., Chanez P., Mary-Ane C. et al. Modulation of eicosanoid and histamine release from human dispersed lung cells by terfenadine // Allergy. 1993; 48: 125–129.
  10. Holgate S., Burns G.., Robinson C. et al. Anaphylactic and calcium-dependent generation of prostaglandin D2 (PGD2), thromboxane B2 and other cyclo-oxygenase products of arachidonic acid by dispersed lung cells and relationship to histamine release // J. Immunol. 1984; 133: 2138–2144.
  11. Campbell A. M., Bousquet J. Anti-allergic activity of H1-blockers // Int. Arch. Allergy Immunol. 1993; 101: 308–310.
  12. Lebel B., Bousquet J., Morel A. et al. Correlation between symptoms and the threshold for release of mediators in nasal secretions during nasal challenge with grass-pollen grains // J. Allergy Clin. Immunol. 1988; 82: 869–877.
  13. Anderson M., Nolte H., Buamgarten C. et al. Suppressive effect of loratadine on allergen-induced histamine release in the nose // Allergy. 1991; 46: 540–546.
  14. Naclerio R. M., Kagey-Sobotka A., Lichtenstein L. M. et al. Terfenadine, an H1 antihistamine inhibits histamine release in vivo in the human // Am. Rev. Respir. Dis. 1990; 142: 167–171.
  15. Togias A. G., Proud D., Kagey-Sobotka A. et al. In vivo and in vitro effects of antihistamines on mast cell mediator release: a potentially important property in the treatment of allergic disease // Ann. Allergy. 1989; 63: 465–469.
  16. Shin M. H., Baroody F., Proud D. et al. The effect of azelastine on the early allergic response // Clin Exp. Allergy. 1992; 22: 189–195.

A. Campbell*
F.-B. Michel*
C. Bremard-Oury**
L. Crampette***
J. Bousquet*

* Service des Maladies Respiratoires & INSERM U454 Hopital Arnaud de Villeneuve, Монпелье, Франция
** Rhone-Poulenc Rorer, SPECIA, Париж, Франция
*** Service d’ORL, Hopital Saint Charles, Монпелье, Франция

Контактная информация об авторах для переписки: jean.bousquet@inserm.fr