Риск отравлений наркотическими препаратами, содержащими морфин

Широкая распространенность острых отравлений опийными наркотиками (героин, морфин и т. д.), а также значительное число в популяции населения РФ лиц, систематически употребляющих опийные наркотики, требует специальных подходов к оценке токсического действия опиатов. Широкое распространение в нашей стране метода количественного определения опиатов в крови показало, что в экспертной практике встречаются как случаи смерти при концентрации морфина до 0,5 мг/л, так и в интервале 2–4 мг/л [4, 5, 6]. При этом у живых лиц в крови встречаются самые разнообразные концентрации морфина от следовых и малых до 2–3 мг/л [2, 4]. Это позволяет предположить, что индивидуальная переносимость морфина и риск ущерба здоровью в значительной мере зависят от степени активности ферментов метаболизма ксенобиотиков и полиморфизма генов, кодирующих эти ферменты.

Это в свою очередь требует определенных оценок, без которых смерть от отравления героином при концентрации в крови 0,5 мг/л и в другом случае 3,5 мг/л при одной и той же непосредственной причине смерти — острой дыхательной недостаточности — без специальных исследований выглядит неубедительно. В зависимости от скорости метаболизма ксенобиотиков и лекарственных средств, в популяции населения выделяют следующие группы:

• Распространенные (активные) метаболизаторы, имеющие нормальный ген того или иного фермента метаболизма.
• Медленные метаболизаторы — носители мутаций гена того или иного фермента метаболизма, приводящих либо к синтезу дефектного фермента, либо вообще к отсутствию синтеза определенного фермента, результатом чего является снижение ферментативной активности или даже ее отсутствие по конкретному субстрату.
• Сверхактивные или быстрые метаболизаторы — носители мутаций гена того или иного фермента метаболизма, приводящих к синтезу фермента с высокой метаболизирующей активностью [1].

Гены, кодирующие ферменты, которые метаболизируют ксенобиотики, характеризуются значительным полиморфизмом, и наличие делеций или «медленных» аллелей может приводить к дисбалансу процессов детоксикации [8, 9].

СYP2D6, CYP2C19 — изоферменты первой фазы метаболизма ксенобиотиков, морфологическим субстратом для которых, наряду с другими ксенобиотиками, являются алкалоиды опия — морфин, кодеин [1]. Наличие «медленных» аллелей в генах, кодирующих эти изоферменты, приводит либо к отсутствию синтеза этих ферментов, либо к синтезу ферментов с низкой активностью.

Целью работы является выявление генетических маркеров, которые отображают программную регуляцию ферментных систем, участвующих в метаболизме ксенобиотиков и конкретно опиатов.

Материалы и методы исследования

Работа основана на результатах анализа наблюдений случаев смерти лиц, погибших с установленными данными употребления наркотических веществ. Проведено аутопсийное исследование 189 трупов лиц, погибших в связи с употреблением наркотиков за период 2005–2007 гг. Исследование трупов проводилось на базе ГУЗООБСМЭ.

Сведения об имевшейся наркотической зависимости в 35 наблюдениях были получены из амбулаторных карт, в 48 случаях в беседе с родственниками и близкими товарищами умерших, а также из материалов уголовных дел и протоколов осмотра трупа на месте происшествия.

При исследовании трупов на длительное использование наркотиков указывали: следы от внутривенных инъекций различной давности — 83 наблюдения (93%), фиброзное очаговое утолщение стенок подкожных вен — 39 наблюдений (43,8%), положительный результат количественного определения концентрации морфина в крови — 174 наблюдения (83,1%).

Из всего массива случаев нами была выделена группа лиц количеством 130 человек, давность наступления смерти которых на момент осмотра трупа в морге не превышала 12 часов. Также была сформирована группа контроля — субъекты до 35 лет, погибшие в результате насильственной смерти, без признаков употребления наркотических веществ внутривенно — 100 человек, давность наступления смерти которых на момент осмотра трупа в морге также не превышала 12 часов. Проводился забор венозной крови (4–5 мл) с антикоагулянтом и последующим получением взвеси лейкоцитов, из которой выделяли ДНК методом перхлоратной экстракции с этанольным осаждением [7]. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ-анализ) генов изоферментов цитохрома Р450, «медленных» мутантных аллелей СYP2D6*3*4, CYP2C19*2*3 [8] проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Использованы олигонуклеотидные праймеры, синтезированные в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Структуры олигонуклеотидных праймеров приведены в табл. 1.

Амплификацию проводили в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 8,9), 50 мМ КCl, 1,7 мМ MgCl, 0,05% Tween 20, с добавлением 0,2 мМ-го раствора dNTP, 0,5 мкМ-го раствора праймеров, 20 нг ДНК и 1,0 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы. Реакционную смесь в объеме 20 мкл покрывали 40 мкл минерального масла. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик».

Анализ рестрикционных смесей проводили с помощью электрофореза в 3% агарозном геле с бромистым этидием.

Результаты исследований были cтатистически обработаны при помощи углового преобразования Фишера и c2. Статистически достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

При исследовании полиморфных вариантов генов CYP2D6*3*4*6 для удобства анализа, а также поскольку 6-я аллель встречалась редко, полиморфизм гена CYP2D6 мы описывали с учетом только аллели 3 и 4. Мы получили 6 групп с генотипами 1/3 1/1 и 3/3 соответственно по 3 аллели и 1/1, 1/4 и 4/4 по 4 аллели. После этого мы вычислили частоту встречаемости данных генотипов среди исследуемых лиц и в группе контроля, а также частоту встречаемости аллелей соответственно. Достоверный уровень статистической значимости различия был получен при исследовании СYP2D6*3, аллель 3/3 (табл. 2). По 4-й аллели достоверный уровень статистической значимости различия выявлен не был, хотя в группе лиц, погибших в связи с употреблением наркотиков, доля наблюдений с генотипом 4/4 возрастала.

Среди исследований генотипов CYP2C19*2*3, которые проводились таким же образом, распределение генотипов и аллелей в исследуемых группах и группе контроля не достигло статистической значимости различия, но количество гомозиготных (медленных) аллелей 2/2 и 3/3 в исследуемой группе лиц, погибших в связи с употреблением морфина, возрастало.

В группе гомозиготных носителей медленных мутантных аллелей СYP2D6 и CYP2C19 были идентифицированы лица, возраст которых составлял от 16 до 20 лет, стаж употребления наркотиков от 1 инъекции до 1 года. При этом, проанализировав результаты количественного определения наркотика в крови этой группы наблюдений, мы установили, что концентрация морфина в крови трупов колебалась от следовых количеств до 0,5 мг/л (табл. 3).

Распространенные метаболизаторы погибают при средних и высоких концентрациях морфина в крови (1–4,0 мг/л).

После этого мы проанализировали причины смерти лиц, погибших в связи с употреблением морфина, среди носителей гомозиготных медленных мутантных аллелей CYP2D6 и CYP2C19. Непосредственной причиной смерти медленных метаболизаторов явилась острая дыхательная недостаточность. На секции мы наблюдали: признаки острой эмфиземы и дистелектазов в легких, субплевральные кровоизлияния, периваскулярные кровоизлияния в стволе головного мозга, острое венозное полнокровие внутренних органов. Следовательно, мы можем говорить о так называемой «смерти на игле» при введении сравнительно небольшой дозы наркотического вещества, которая для них явилась смертельной.

Определяющим в морфогенезе острого отравления опиатами является полиморфизм генов, контролирующих скорость первой фазы метаболизма ксенобиотиков. Медленные метаболизаторы (гомозиготы по мутантным аллелям СYP2D6*3*4, CYP2C19*2*3) погибают при сверхмалых концентрациях морфина в крови (до 0,5 мг/л). Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов СYP2D6*3A и СYP2D6*4A выявил достоверные отличия между лицами, употреблявшими наркотические вещества, и группой контроля.

По результатам исследования изоферментов цитохрома Р450 можно полагать, что острые отравления характерны в основном в случаях, где манифестируют медленные метаболизаторы ксенобиотиков — гомозиготные носители «медленных» мутантных аллелей генов CYP2D6 и CYP2C19.

Для оценки спорных и сложных случаев отравления сверхмалыми дозами опиатов (менее 0,5 мг/л) в крови следует помимо морфологической картины и непосредственной причины смерти исследовать генетический полиморфизм СYP2D6*3*4.

Таким образом, однозначно выявляются медленные метаболизаторы, которые погибают сразу после инъекции обычной и даже небольшой дозы наркотика, и распространенные и быстрые метаболизаторы, которые погибают, как правило, через несколько лет после начала употребления наркотиков.

Исходя из полученных в работе результатов, мы полагаем, что имеется реальная необходимость исследования полиморфных вариантов генов (СYP2D6*3A и СYP2D6*4A, CYP2C19*2A и CYP2C19*3A) на предмет выявления медленных метаболизаторов. Это позволит не применять с медицинскими и иными целями анальгетики с морфинным циклом.

Учитывая тот факт, что генетическая характеристика метаболизма сохраняется в течение всей жизни, необходимо доводить эту информацию (конкретные варианты СYP2D6*3A и СYP2D6*4A, CYP2C19*2A и CYP2C19*3A) до сведения пациента и отмечать в медицинской документации.

Совершенно очевидно, что эта группа лиц подвержена риску внезапной смерти при любых вариантах употребления веществ с морфинным циклом.

Геномный подход к изучению вариаций индивидуальных реакций организма на введение ксенобиотиков, в том числе и наркотических анальгетиков с морфинным циклом, позволит разработать подходы к индивидуальному дозированию препаратов, в зависимости от активности изоферментов (СYP2D6*3A и СYP2D6*4A, CYP2C19*2A и CYP2C19*3A), а также существенно снизить риск развития отравлений. При назначении наркотических анальгетиков с морфинным циклом необходимо учитывать, что полиморфизм изофермента 2D6 ответствен за метаболизм не только наркотических анальгетиков, но и многих других лекарственных средств, которые, в свою очередь, могут индуцировать или ингибировать его действие, тем самым ускоряя или подавляя метаболизм. Данное обстоятельство может привести к кумуляции лекарственного препарата и развитию нежелательных эффектов и передозировки. Большим преимуществом генотипирования как метода индивидуализации фармакотерапии вообще и наркотических анальгетиков в частности является постоянство полученных результатов в течение всей жизни пациента и малая инвазивность метода.

Литература

1. Пальцев М. А. Введение в молекулярную медицину. М.: Медицина. 2004, с. 196–199.
2. Пиголкин Ю. И., Богомолов Д. В. Морфологические изменения внутренних органов при опийной наркомании // Архив патологии. 2002. Т. 64, № 1. С. 3–5.
3. Тимофеев И. В. Патология лечения. Руководство для врачей. СПб: Северо-Запад, 1999. С. 76–78.
4. Шабанов П. Д. Наркология: Практическое руководство для врачей. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. 560 с.
5. Шигеев С. В., Жаров В. В. Судебно-медицинское диагностическое значение содержания морфина в крови и моче // Судебно-медицинская экспертиза. 2005, № 5, с. 39–42.
6. Шигеев С. В. Судебно-медицинская оценка острых отравлений опиатами // Проблемы экспертизы в медицине. 2005. № 1, с. 25–26.
7. Johns M., Paulus-Thomas J. Purification of human genomic DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol // Anal. Biochem. 1989. V. 80, № 2. P. 276–278.
8. Lapple F., von Richter O., Fromm M. F., Richter T., Thon K. P., Wisser H., Griese E. U., Eichelbaum M., Kivisto K. T. Differential expression and function of CYP2C19 isoforms in human intestine and liver // Pharmacogenetics. 2003. 13: 565–575.

В. В. Сорокина, кандидат медицинских наук

ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Росздрава», Омск

Контактная информация об авторе для переписки: vpkonev@mail.ru

Структуры олигонуклеотидных праймеров

Частота встречаемости генотипов гена CYP2D6*3

Абсолютные показатели распределения концентрации наркотика в крови трупа среди гомозиготных аллелей СYP2D6*3*4, CYP2C19*2*3